黃連溫膽湯含藥血清干預IR-3T3-L1細胞的最佳濃度與時間篩選

韓宇博，田苗，劉紫君，婁宏君，王瑞楠，張丹丹，郭東浩，劉莉*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指機體對胰島素調節(jié)作用/葡萄糖利用敏感度反應下降，代償性增加胰島素分泌水平，以保持內環(huán)境及血糖穩(wěn)態(tài)[1-2]。中醫(yī)藥在改善IR從而防治代謝性疾病及糖尿病方面具有鮮明特點，筆者前期研究[3-6]發(fā)現(xiàn)：黃連溫膽湯可降低飲食誘導代謝綜合征大鼠血壓、血糖、體質量、血脂水平，降低炎性細胞因子及脂聯(lián)素水平，可上調胰島素受體底物、葡萄糖轉運體等基因的mRNA和蛋白表達，改善IR?；隗w外細胞培養(yǎng)體系研究黃連溫膽湯含藥血清的作用機制具有重要意義。體外研究中，如何制定含藥血清與細胞培養(yǎng)體系的比例，能夠產生最佳干預效果，是亟須解決的問題。因此本研究探討黃連溫膽湯含藥血清干預IR-3T3-L1細胞的最佳濃度與時間，為后續(xù)進一步的機制研究提供確切的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗細胞株及動物

3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞購買于中國科學院細胞庫。30只SPF級雄性SD大鼠購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，體質量(200±20)g，動物許可證號：SCXK(黑)2 015 006。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24 ℃，相對濕度40%～50%；飼養(yǎng)密度為5只/籠，自由飲食水，隔日更換墊料，適應性飼養(yǎng)1周后用于實驗研究，研究過程符合動物倫理學要求。

1.2 實驗藥品

黃連溫膽湯：黃連10 g，清半夏10 g，竹茹15 g，枳實10 g，陳皮15 g，茯苓10 g，生姜5 g，炙甘草10 g，所有飲片購自黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院草藥局，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院生藥學教研室鑒定，符合2015版《中華人民共和國藥典》一部要求。鹽酸二甲雙胍標準品購自天津阿爾法生物科技有限公司。

1.3 實驗試劑

OriCellTMSD大鼠骨髓間質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基試劑盒(賽業(yè)生物科技有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone)，胰蛋白酶(Gibco)，PBS(HyClone)，地塞米松(Sigma)，DMSO(Sigma)，戊巴比妥鈉(Sigma)，葡萄糖測定試劑盒(中生北控生物科技公司)，葡萄糖氧化酶(Glucose oxidas，GOD)Elisa試劑盒(Mobio)，CCK-8試劑盒(索萊寶)。

1.4 實驗儀器

BSC-1300IIAz生物安全柜(江蘇蘇凈集團)，CKX41 FS倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)，MCO-18AC二氧化碳培養(yǎng)箱(Panasonic)，MULTISKAN FC酶標儀(Thermo)，SORVALL ST8/8R低溫離心機(Thermo)等。

2 方法

2.1 黃連溫膽湯含藥血清的制備

將黃連溫膽湯各飲片混合，加入14倍量的蒸餾水，煎煮3次，每次煎煮1 h，紗布過濾，3次藥液合并，減壓濃縮至稠膏狀，并用凍干機做成凍干粉。30只SD大鼠用隨機數(shù)字法分為黃連溫膽湯組15只，空白組15只，黃連溫膽湯組每日灌服黃連溫膽湯凍干粉稀釋液(2.1 g生藥/mL，每100 g體質量給予2 mL藥液)，空白組每日灌服與中藥組等體積蒸餾水，每日早、晚各灌胃1次，連續(xù)灌胃5次，于末次灌胃1 h后將大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，無菌條件下腹主動脈采血并分離血清，0.22 μm微孔濾膜過濾，56 ℃,30 min滅活，分裝并區(qū)分標注為空白血清和含藥血清，-80 ℃保存?zhèn)溆肹7]。

2.2 誘導3T3-L1細胞成脂分化

參照OriCellTMSD大鼠骨髓間質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基試劑盒說明書，在超凈工作臺中配制誘導培養(yǎng)基A液和B液，確?；旌暇鶆蛑蠹纯墒褂?。其中A液包括基礎培養(yǎng)基175 mL，F(xiàn)BS 20 mL，雙抗2 mL，谷氨酰胺2 mL，地塞米松200 μL，胰島素400 μL，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤200 μL，羅格列酮200 μL；B液包括基礎培養(yǎng)基175 mL，F(xiàn)BS 20 mL，雙抗2 mL，谷氨酰胺2 mL，胰島素400 μL。5%CO2，37 ℃培養(yǎng)條件下的3T3-L1細胞，每隔3 d換增殖培養(yǎng)基1次，直到細胞融合達到100%或者過融合；移除細胞增殖培養(yǎng)基，向60 mm培養(yǎng)皿中加入3 mL誘導培養(yǎng)基A液維持3 d，更換培養(yǎng)液為2 mL B液維持24 h，再換回A液，如此反復3個循環(huán)，用B液維持培養(yǎng)4～7 d直到脂滴變得足夠大、圓。油紅染色并在倒置顯微鏡下拍照。

2.3 胰島素抵抗3T3-L1細胞模型構建及分組

在96孔板上培養(yǎng)3T3-L1成纖維細胞，成脂分化后加入含有1 μmol/L地塞米松的增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 h即可構建IR-3T3-L1脂肪細胞模型，且36 h內模型穩(wěn)定[8-9]。將IR-3T3-L1脂肪細胞隨機分為模型組(8%空白血清)、中藥高劑量組(8%含藥血清)、中藥中劑量組(4%含藥血清+4%空白血清)、中藥低劑量組(2%含藥血清+6%空白血清)和二甲雙胍組(8%空白血清+1 mmol/L鹽酸二甲雙胍溶液)，另外選用分化成熟的3T3-L1細胞作為正常組(8%空白血清)，共6組，每組3個復孔，分別在加藥后12 h、24 h和36 h收取培養(yǎng)板各孔剩余培養(yǎng)液，用于指標測定。

2.4 檢測指標測定方法

CCK-8測定細胞活力：向培養(yǎng)板的每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育1 h；用酶標儀測定在450 nm處的吸光度，計算細胞活力；參照葡萄糖測定試劑盒說明書完成培養(yǎng)液葡萄糖含量檢測，葡萄糖消耗量=未接種細胞的培養(yǎng)液葡萄糖含量-樣本培養(yǎng)液葡萄糖含量；應用ELISA法檢測培養(yǎng)液中GOD含量。

2.5 統(tǒng)計方法

應用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用“均數(shù)±標準差”表示，多組間樣本比較采用單因素方差分析，非正態(tài)分布樣本多組間樣本比較采用非參數(shù)檢驗；認為P<0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 誘導3T3-L1細胞成脂分化情況

如圖1所示，3T3-L1小鼠成纖維細胞復蘇后貼壁良好，細胞呈梭形，細胞內無脂滴；3T3-L1達到融合狀態(tài)后，加入誘導培養(yǎng)基A液作用3 d，再更換為誘導培養(yǎng)基B液作用1 d，如此反復3個循環(huán)，細胞回縮變圓，細胞內逐漸出現(xiàn)脂滴；繼續(xù)應用誘導培養(yǎng)基B液作用4～7 d，細胞內充滿脂滴，呈典型的“戒環(huán)狀”；油紅染色成功，脂滴被染為紅色，可見3T3-L1細胞誘導分化率達80%以上。

3.2 細胞活力水平比較

如表1所示，干預12 h和36 h時，各組OD450nm較正常組下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；干預24 h時，模型組和二甲雙胍組OD450nm較正常組下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：A：3T3-L1小鼠成纖維細胞復蘇后狀態(tài)；B：3T3-L1細胞第3次換入誘導培養(yǎng)基B液；C：3T3-L1細胞繼續(xù)用誘導培養(yǎng)基B液培養(yǎng)4天；D：3T3-L1脂肪細胞油紅O染色。圖1 誘導3T3-L1細胞成脂分化情況(100×)

表1 各組CCK-8孵育后吸光度水平比較

如圖2所示，干預12 h、24 h和36 h的各組間細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，干預12 h、24 h時，中藥高、中、低劑量組細胞活力相當，干預36 h時，中藥高、低劑量組細胞活力較中藥中劑量組有下降趨勢。

圖2 12 h、24 h及36 h各組細胞活力水平

3.3 葡萄糖消耗量水平

如表2所示，藥后干預12 h、24 h及36 h，正常組葡萄糖消耗量均高于其余5組；各組給藥干預12 h，模型組葡萄糖消耗量明顯低于其余5組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；各組給藥干預24 h后，各組葡萄糖消耗量較12 h增高，但中藥低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余各組葡萄糖消耗量仍高于模型組(P<0.05)；各組給藥干預36 h后，中藥高劑量組和中藥低劑量組葡萄糖消耗量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，僅中藥中劑量組和二甲雙胍組葡萄糖消耗量較模型組升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著取樣時間點的推遲，各組葡萄糖消耗量增加，模型組與各用藥組間差值增大。

表2 各組12 h、24 h、36 h取樣點葡萄糖消耗量水平 的比較

3.4 ELISA測得葡萄糖氧化酶水平

標準曲線回歸方程：Y=0.035 02+0.019 92X，R2=0.999 71；所有數(shù)據(jù)處理均去除本底，即去除孔板本身的OD值。將各組檢測所得OD值代入回歸方程，得到各組葡萄糖氧化酶濃度(GOD),見表3。干預12 h和24 h時，各組培養(yǎng)基中GOD濃度水平相當，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；干預36 h時，模型組培養(yǎng)基中GOD濃度低于中藥中劑量組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 各組間葡萄糖氧化酶水平的比較

4 討論

血清藥理學是由日本學者田代真一首次提出的，它是一種研究非單體藥物的藥理學方法，通過實驗對象經(jīng)口給藥一段時間后采集血液，制備含藥血清，從而模擬藥物從體內經(jīng)吸收代謝后出現(xiàn)的新成分和產物。由于這種方法提取的含藥血清比較接近藥物在體內的代謝情況，所以更適合藥物種類繁多、成分復雜、含量不確定的中藥復方研究。本實驗屬中藥血清藥理學范疇，其意義在于模擬體內藥理活動過程，是中藥藥理學研究的重要方法，自發(fā)明以來被廣泛使用[10]。

目前誘導3T3-L1脂肪細胞的方法很多，最常用的是傳統(tǒng)“雞尾酒”法[11]，但“雞尾酒”法存在諸多影響因素，例如FBS的質量、誘導劑的配制、誘導劑作用時間、細胞融合程度等，因此涌現(xiàn)出大量學者研究誘導配方的改進，尚無統(tǒng)一造模方法可供參考。考慮使用已經(jīng)商品化的OriCellTMSD大鼠骨髓間質干細胞成脂誘導分化培養(yǎng)基試劑盒進行實驗，減少影響因素。雖然該試劑盒主要應用于骨髓間質干細胞成脂分化，但其具有增強趨向脂肪細胞分化的能力，同時誘導培養(yǎng)基A組成較傳統(tǒng)“雞尾酒”法多了羅格列酮溶液，羅格列酮是噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，可激活特異性過氧化物酶體增殖因子γ型受體，Vishwanath D[12]等研究與其相似，在傳統(tǒng)“雞尾酒”法加入曲格列酮溶液(同屬噻唑烷二酮類胰島素增敏劑)后明顯提高3T3-L1細胞誘導分化率。在本實驗中，誘導時間持續(xù)16～19 d，相比于傳統(tǒng)方法誘導時間較長，但實驗重復性較好，經(jīng)油紅O染色鑒定，認為成脂分化率可穩(wěn)定維持在80%以上。

目前，IR-3T3-L1脂肪細胞模型的建立方法主要有：①炎癥因子刺激，例如腫瘤壞死因子α[13]、白介素6[14]等；②棕櫚酸或游離脂肪酸刺激[15]；③高濃度胰島素刺激[16]；④糖皮質激素刺激，例如地塞米松[17]。本實驗應用含1 μmol/L地塞米松的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)分化成熟的3T3-L1脂肪細胞，建立IR-3T3-L1脂肪細胞模型。進一步用于黃連溫膽湯含藥血清干預IR-3T3-L1脂肪細胞最佳濃度和時間的篩選。

黃連溫膽湯含藥血清所產生的量效關系與動物的給藥量及體外培養(yǎng)體系中血清的濃度共同決定，前期研究中，依據(jù)含藥血清色譜峰強度及數(shù)量分析實驗，已經(jīng)確定了大鼠的給藥量，因此，本實驗中將相對固定的黃連溫膽湯含藥血清以不同比例加入到培養(yǎng)體系，以期明確體外培養(yǎng)體系中黃連溫膽湯含藥血清的最佳配比關系。本實驗設定整個培養(yǎng)體系中總血清濃度所占比為13%，其中FBS濃度占5%，因為從3T3-L1成纖維細胞誘導分化為脂肪細胞，再到建立胰島素抵抗模型，培養(yǎng)體系中均含有FBS，全部換為大鼠含藥血清或正常血清易引起3T3-L1脂肪細胞“不適”，對生長環(huán)境感到陌生，維持5%FBS濃度的目的就是為了保證3T3-L1脂肪細胞以較好狀態(tài)存活，排除細胞自身的影響。筆者將黃連溫膽湯含藥血清分為3個不同比例，分別是8%、4%和2%，將其命名為中藥高、中、低劑量組，余下血清用正常大鼠血清補充，以保證各組間相對一致，具有可比性。IR-3T3-L1脂肪細胞模型在36 h內較為穩(wěn)定[8]，因此本研究在36 h內設定了3個取樣點，分別為12 h、24 h和36 h，通過觀察不同濃度黃連溫膽湯含藥血清對IR-3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量、葡萄糖氧化酶含量和細胞活力的影響，篩選含藥血清干預IR-3T3-L1的最佳濃度和最佳時間。

CCK-8法是目前常用于測定細胞活力的方法之一[18-19]。本實驗結果表明，黃連溫膽湯含藥血清及二甲雙胍溶液對IR-3T3-L1脂肪細胞活性無明顯影響，該濃度的范圍的黃連溫膽湯含藥血清及二甲雙胍溶液的細胞毒性可忽略不計。各組干預24 h的實驗結果中，模型組和二甲雙胍組OD450nm較正常組下降，但經(jīng)細胞活力公式計算后二者無差異，說明培養(yǎng)板、培養(yǎng)基及CCK-8溶液本身可能存在對吸光度的影響，在排除它們的干擾后，本實驗結果較為準確，認為黃連溫膽湯含藥血清不同濃度及不同作用時間對IR-3T3-L1脂肪細胞活力無明顯影響，對于最佳藥物濃度及干預時間的篩選，可忽略細胞活力的影響。

本實驗進一步檢測各組培養(yǎng)基中葡萄糖消耗情況，實驗結果表明：黃連溫膽湯各劑量組和二甲雙胍能夠改善3T3-L1脂肪細胞的IR程度，隨著取樣時間點的推遲，各組葡萄糖消耗量逐漸增加，模型組與各用藥組間差值增大。在干預36 h時，模型組與其他用藥組葡萄糖消耗量差值最大，可見干預時間達到36 h時，用藥組發(fā)揮了最大改善胰島素抵抗的作用，但僅有中藥中劑量組、二甲雙胍組與模型組差異具有統(tǒng)計學意義，說明隨著干預時間的推移，中藥高、低劑量兩組提高葡萄糖消耗量的作用逐漸減弱，只用中藥中劑量組和二甲雙胍組能夠一直保持提高葡萄糖消耗量的作用，因此推測中劑量的黃連溫膽湯含藥血清(4%)干預IR-3T3-L1脂肪細胞36 h，可明顯改善其胰島素抵抗水平，增加葡萄糖消耗量及葡萄糖的利用度。

本實驗亦應用ELISA法測定各組培養(yǎng)基中GOD含量，首先是想明確3T3-L1脂肪細胞培養(yǎng)基中是否含有GOD，目前的結果顯示培養(yǎng)基中含有GOD，而且在干預36 h中藥中劑量組明顯出現(xiàn)提高葡萄糖消耗量的同時，中劑量組GOD含量與模型組比較差異明顯，說明在藥物的干預作用下，可調節(jié)IR-3T3-L1脂肪細胞培養(yǎng)基中的GOD含量，而且GOD來源于細胞，通過某種機制將胞內的GOD釋放到培養(yǎng)基中，但應考慮樣本量的限制，由于是進行最佳藥物劑量和最佳干預時間的篩選，所以本實驗每組設計3個復孔，若想明確GOD含量變化情況，可在后續(xù)實驗中擴大樣本量，同時提高實驗的重復性。本實驗中檢測的是培養(yǎng)基中的GDO含量，可能存在細胞外影響機制，后續(xù)實驗考慮棄掉培養(yǎng)基，通過裂解細胞，檢測細胞內GOD含量，以明確問題所在。

綜上所述，黃連溫膽湯含藥血清及二甲雙胍溶液無細胞毒性，對IR-3T3-L1脂肪細胞的活力無影響，在最佳藥物濃度及干預時間的篩選時可忽略細胞活力的因素，僅考慮葡萄糖消耗量的變化即可。最終確定中劑量的黃連溫膽湯含藥血清(4%)干預IR-3T3-L1脂肪細胞36 h是最佳給藥方案，可用于后續(xù)機制探討的實驗研究。