五加生化膠囊對早孕大鼠藥物流產(chǎn)出血干預(yù)作用的代謝組學研究

張寧，方衡，張愛華，閆廣利，祁永華，李貴森，王發(fā)善，王喜軍*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學 國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物 化學重點研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學技術(shù)合作中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥 大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007；3.多多藥業(yè)有限公司，黑龍江 佳木斯 154002)

五加生化膠囊源于產(chǎn)后圣方《生化湯》[1]，由刺五加、當歸、川芎、桃仁、甘草和干姜6味藥材組成，功效益氣養(yǎng)血、活血化瘀、行氣止痛，主治婦女產(chǎn)后惡露不行及婦女氣虛血瘀或虛寒夾瘀所致痛經(jīng)等證[2]。代謝組學作為飛速發(fā)展起來的熱門技術(shù)，是考察機體代謝產(chǎn)物(小分子)隨時間動態(tài)變化特點的一門新學科[3-5]。相比臨床常用的酶學指標檢測，具有高效率、速度快、應(yīng)用廣及高靈敏度等特點[6]。目前對五加生化膠囊的研究多集中于臨床指標觀察及質(zhì)量控制[7-13]，對其致病機制的研究報道較少。本文首次采用代謝組學方法探討五加生化膠囊對早孕大鼠藥物流產(chǎn)出血干預(yù)作用的機制，為中西醫(yī)臨床應(yīng)用五加生化膠囊治療藥物流產(chǎn)出血提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

180～220 g的Wistar雌性大鼠，購于黑龍江中醫(yī)藥大學GLP實驗室，合格證號：SCXK黑2008-004。

1.2 儀器、試劑與藥物

Agilent6890N氣相色譜儀、5975B質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；HP-5 MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，正華生物儀器設(shè)備有限公司)；KPJ-1A型烤片機、TSJ-1A型自動組織脫水機、BMJ-1型生物組織包埋機(天津航空機電公司)；Ⅸ-71-21PH型Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus株式會社)；KD-2508型輪轉(zhuǎn)切片機(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司)；N-甲基-三甲基硅烷基-三氟乙酰胺(MSTFA，英國Apollo Scientific有限公司)；三甲基一氯硅烷(TMCS，美國Acros Organics公司)；五加生化膠囊(批號：0911251,多多藥業(yè)有限公司)；米非司酮片、米索前列醇片(批號：H1095003、H20010456,北京紫竹藥業(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 灌胃藥液制備

米非司酮混懸液配制：取米非司酮片3片(25 mg/片)，搗碎溶于75 mL生理鹽水中，超聲10 min，即得；米索前列醇混懸液配制：取米索前列醇片3片(200 μg/片)，搗碎溶于60 mL生理鹽水中，超聲10 min，即得；五加生化膠囊混懸液配制：充分研磨五加生化膠囊內(nèi)容物，過篩后使每毫升混懸液含生藥量0.25 g[14]。

2.2 藥物流產(chǎn)出血模型

將動情大鼠以王氏造模方法[15]按雌雄比2∶ 1合籠，次日早對陰道涂片進行檢查，顯微觀察到精子即受孕第1天。挑選受孕后大鼠，隨機分為4組(8只/組)，即正常組、受孕對照組、模型組和五加生化組。模型組和五加生化組大鼠于實驗第7天分別灌胃給予米非司酮和米索前列醇，灌胃劑量0.13 g/kg。

2.3 給藥方案

模型組自藥物流產(chǎn)第1天起，灌胃給予生理鹽水(1 mL/100 g)，連續(xù)7 d；五加生化組自藥物流產(chǎn)第1天起，灌胃給予五加生化膠囊混懸液(1 mL/100 g)，連續(xù)7 d[16]，正常組和受孕對照組灌胃給予蒸餾水。

2.4 樣品的采集

2.4.1 血清樣品采集

采集血樣前禁食不禁水12 h，在實驗第1、8,14天眼眶取血，實驗結(jié)束時下腔靜脈取血，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4.2 藥物流產(chǎn)出血時間及血樣收集

自實驗第8天，放置棉球于大鼠陰道內(nèi)(相隔6 h·次-1·d-1)，觀察其是否有血漬，并收集于-20 ℃冰箱。藥物流產(chǎn)出血時間為取出棉球無血漬時間距離第1次取出棉球時間。

實驗進行至14 d時，將NaOH溶液(5 %，4 mL)加入各組大鼠尾靜脈血(0.02 mL)混勻。用5%NaOH溶液浸泡并搓洗收集棉球的血漬，根據(jù)出血量適當調(diào)整溶液用量并記錄。過濾浸提液，分別將大鼠尾靜脈血5%NaOH溶液、已過濾的浸提液各4 mL檢測其吸光度A值(546 nm)，并計算子宮出血量。

2.5 指標檢測

2.5.1 子宮組織病理學檢查

實驗第14天，用4%中性緩沖多聚甲醛液固定新鮮大鼠子宮組織，經(jīng)處理后，用蘇木素-伊紅進行染色，封片后進行顯微鏡下觀察。

2.5.2 血清代謝組學研究

2.5.2.1 樣本預(yù)處理

取150 μL解凍后血清，加入450 μL甲醇，渦漩3 min，冰水浴10 min后離心(10 000 r/min，10 min，4 ℃)。取上清液400 μL氮吹干。加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(15 mg/mL)渦漩混勻，70 ℃下反應(yīng)1 h，加入75 μL衍生化試劑(MSTFA∶ TMCS=100∶ 1)，密封渦漩混勻，70 ℃條件下放置1 h。室溫冷卻后加150 μL含二十二烷(0.10 mg/mL)的正庚烷渦漩，離心(10 000 r/min，4 ℃，10 min)后取上清液進行GC-MS分析。

2.5.2.2 GC-MS分析

氦氣作為載氣，流速恒為1.0 mL/min；不分流進樣，進樣量2 μL，進樣口溫度為280 ℃；程序升溫：開始時85 ℃保持5 min，以10 ℃/min升至128 ℃，保持2 min，以15 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至220 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃保持10 min；EI離子源70 eV；離子源溫度：230 ℃，四極桿溫度：150 ℃；調(diào)諧方式：自動調(diào)諧；質(zhì)量掃描方式及范圍：全掃描，50～1 000 aum。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 五加生化膠囊對藥物流產(chǎn)出血大鼠子宮組織形態(tài)的影響

正常組大鼠子宮組織及子宮腔狀態(tài)均正常；受孕對照組大鼠子宮組織中滋養(yǎng)細胞存在明顯；模型組大鼠子宮組織中沒有明顯的滋養(yǎng)細胞存在，蛻膜細胞呈片狀壞死，部分出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，子宮腔含較多瘀血；五加生化組大鼠子宮組織蛻膜細胞存在不明顯，子宮腔中不含瘀血。見圖1。

3.2 五加生化膠囊對藥物流產(chǎn)大鼠子宮出血量及出血時間的影響

如表1所示，與正常組相比，模型組子宮出血量及出血時間顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，五加生化組子宮出血量明顯減少(P<0.05),出血時間顯著縮短(P<0.01)。

注：A：正常組；B：受孕對照組；C：模型組；D：五加生化組。圖1 大鼠子宮組織形態(tài)(HE染色,100×)

表1 大鼠子宮出血量及出血時間

3.3 代謝輪廓分析

見圖2，用PCA法分析大鼠血清樣本，繪制反映組間離散程度的2D得分圖，可視化樣本分析結(jié)果。

3.4 藥物流產(chǎn)出血代謝標記物的確定

如圖3所示，采用EZinfo2.0軟件針對性的建立正常組和模型組間的OPLS-DA分析，以顯示化合物對離散趨勢貢獻程度，結(jié)合對組分有貢獻意義的VIP值,確定VIP>1.2為潛在標記物。使用NIST05a質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索篩選出來的化合物，為甘氨酸、2-丁烯二酸、絲氨酸、氨基丙二酸、L-焦谷氨酸、磷酸甘油酯、L-鳥氨酸、L-賴氨酸、D-半乳糖、L-酪氨酸、D-葡萄糖酸、花生四烯酸、2-單棕櫚酸甘油酯，2-單硬脂酸甘油酯和膽固醇等15個潛在代謝標記物。

注：A為實驗第1天；B為實驗第2天；C為實驗第8天。圖2 正常組、模型組和五加生化組的PCA分析圖

注：K為正常組，M為模型組;A為Score圖;B為S-plot圖。圖3 實驗第14天正常組和模型組在OPLS-DA模式下的score、S-Plot圖

3.5 潛在生物標記物的相對峰面積

潛在代謝標記物的相對峰面積數(shù)值反映了該代謝標記物的含量。正常組、模型組和五加生化組的潛在代謝標記物相對峰面積結(jié)果見表2。與正常組比較，模型組大鼠血清中甘氨酸、氨基丙二酸、L-焦谷氨酸、L-酪氨酸(P<0.01)含量和絲氨酸、L-鳥氨酸、膽固醇(P<0.05)含量顯著降低，2-丁烯二酸、磷酸甘油酯、L-賴氨酸、D-半乳糖、D-葡萄糖酸、2-單棕櫚酸甘油酯和2-單硬脂酸甘油酯相含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，五加生化組大鼠血清中甘氨酸、絲氨酸、氨基丙二酸、L-鳥氨酸、L-酪氨酸、花生四烯酸(P<0.01)，L-焦谷氨酸和膽固醇(P<0.05)含量顯著升高，2-丁烯二酸、磷酸甘油酯、2-單棕櫚酸甘油酯、2-單硬脂酸甘油酯(P<0.01)、L-賴氨酸，D-半乳糖和D-葡萄糖酸(P<0.05)含量顯著降低。

表2 潛在代謝標記物的相對峰面積

4 討論

從潛在生物標記物的角度來看，給予米非司酮和米索前列醇后，主要影響了動物機體內(nèi)脂肪酸、糖及氨基酸的代謝。

脂肪酸代謝過程中，腸道菌群代謝對其生物合成和代謝有調(diào)控作用，脂肪酸的含量和組成變化會反作用于機體，影響能量供應(yīng)[17]，導(dǎo)致體溫變化從而影響酶的活性作用，繼而使氨基酸的代謝發(fā)生改變。本實驗通過VIP predictive和t檢驗，共找到相關(guān)潛在性標記物15個并對其含量進行了分析，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，2-羥基丁酸、磷酸甘油酯、L-賴氨酸、D-半乳糖、D-葡萄糖酸，2-單棕櫚酸甘油酯和2-單硬脂酸甘油酯含量升高，甘氨酸、絲氨酸、氨基丙二酸、L-焦谷氨酸、L-鳥氨酸、L-酪氨酸，花生四烯酸和膽固醇含量降低。實驗第14天，在五加生化組中相關(guān)潛在生物標記物具有回調(diào)趨勢。

單硬脂酸甘油酯和單棕櫚酸甘油酯是飽和脂肪酸和棕櫚酸的代謝產(chǎn)物，服用米非司酮和米索前列醇后，其含量降低，影響了脂肪酸的代謝?；ㄉ南┧嶙鳛橐环N人體必需的主要分布于機體脂肪、腦、肝臟等器官的不飽和脂肪酸，血栓素和前列素等的合成均能受其影響[18-19]。且花生四烯酸具有調(diào)節(jié)血小板聚集、平滑肌收縮、炎性細胞因子的產(chǎn)生等一系列生理活性[20]，因此，花生四烯酸的代謝在體內(nèi)顯得尤為重要?？诜追撬就兔姿髑傲写紝?dǎo)致藥物流產(chǎn)出血，影響了脂肪酸代謝，其中降低了花生四烯酸在血清中的濃度，影響了大鼠子宮平滑肌的收縮，使蛻膜組織不能順利排出體外，刺激子宮內(nèi)膜，使出血時間延長。影響了血液凝固和血液黏度，使子宮出血不止，子宮受損處無法及時修復(fù)而導(dǎo)致出血時間延長。

由于藥物流產(chǎn)出血對脂肪酸的代謝及糖代謝的影響，使得氨基酸代謝也受到影響。氨基酸代謝需要大量的酶參與，一旦能量代謝途徑發(fā)生異常，體溫會受到很大影響，將直接影響酶的活性，繼而影響氨基酸代謝。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠甘氨酸、鳥氨酸、焦谷氨酸、絲氨酸和酪氨酸含量明顯降低，賴氨酸含量升高，說明藥物流產(chǎn)出血影響了氨基酸代謝。而含量變化顯著的絲氨酸與本實驗密切相關(guān)。絲氨酸屬于非必需氨基酸，高度集中在所有細胞膜上，在細胞增殖中起著核心作用。絲氨酸合成的數(shù)量不足將直接導(dǎo)致細胞的生長受到抑制。藥物流產(chǎn)出血后，影響了絲氨酸的代謝，抑制了其合成，受損細胞生長受阻，組織修復(fù)緩慢，導(dǎo)致流產(chǎn)出血時間延長，可能是藥物流產(chǎn)出血時間長的機制之一。

綜上所述，五加生化膠囊可在一定程度上對大鼠的藥物產(chǎn)后出血產(chǎn)生治療作用，其作用可能是通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝及氨基酸的產(chǎn)生等途徑來實現(xiàn)的。本實驗對于深入研究和揭示中藥復(fù)方治療藥物流產(chǎn)出血的多靶點治療特點和優(yōu)勢具有重要意義。