維生素D受體基因多態(tài)性與昆明地區(qū)2型糖尿病伴骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系

牛 玲 ，李博一 ，毛靜秋 ，唐 艷 ，馬 蓉 ，劉 方 ，張 程 ，韓竹君 ，苗翠娟 ，張 嫻

（1）昆明市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科；2）檢驗(yàn)科，云南 昆明 650011）

糖尿病患者易同時(shí)合并骨質(zhì)疏松癥。由于骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折和骨折致殘嚴(yán)重影響患者生活，同時(shí)給家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此重視防治糖尿病性骨質(zhì)疏松對(duì)于提高糖尿病患者的生活質(zhì)量具有重要意義。遺傳是T2DM和OP重要的發(fā)病因素，有研究[1]認(rèn)為糖尿病性骨質(zhì)疏松是一種多基因遺傳病，這些基因包括降鈣素受體基因、維生素D受體（vitamin dreceptor，VDR）基因及護(hù)骨素基因等。目前，對(duì)VDR基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系研究報(bào)道較多，但國(guó)內(nèi)研究結(jié)果尚不完全一致。本研究旨在探討VDR基因多態(tài)性與昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系，以期為昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松癥防治提供理論依據(jù)，并早期防治糖尿病性骨質(zhì)疏松，提高糖尿病患者的生活質(zhì)量。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年6月至2019年1月在昆明市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科住院治療的2型糖尿病患者237例，其中男性122例，女性115例，年齡50～84歲，平均（64.68±7.92）歲。2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2013年版《中國(guó)2型糖尿病防治指南》標(biāo)準(zhǔn)診斷糖尿病[2]。骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2011年版《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南》標(biāo)準(zhǔn)診斷[3]，按T值評(píng)分診斷骨質(zhì)疏松。所有入選的2型糖尿病患者在昆明地區(qū)居住時(shí)間均大于10 a。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）1型糖尿病，繼發(fā)性糖尿??；（2）各種糖尿病急性并發(fā)癥、伴有感染、營(yíng)養(yǎng)不良、嚴(yán)重心腦及肝腎疾病、腫瘤患者；（3）甲狀腺手術(shù)史，合并其他可能引起甲狀腺激素代謝異常的其他內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織病者，如垂體瘤、垂體功能減退者，亞急性甲狀腺炎等；（4）皮膚疾病無(wú)法接受陽(yáng)光照射者；（5）存在類風(fēng)濕或風(fēng)濕或關(guān)節(jié)炎，且應(yīng)用激素類藥物時(shí)間超過(guò)6個(gè)月，或曾經(jīng)接受活性維生素D、降鈣素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑等影響骨代謝的藥物治療者；（6）存在畸形性骨關(guān)節(jié)炎者和成骨不全患者。納入的研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，且本研究經(jīng)昆明市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 分組

（1）將237例患者按骨密度檢測(cè)結(jié)果分為糖尿病無(wú)骨質(zhì)疏松癥61例；糖尿病合并骨量減少111例；糖尿病伴骨質(zhì)疏松65例。

（2）將237例患者按VDR基因型分組為：BB組31例，占13.1%；Bb組184例，占77.6%，bb組22例，占9.3%。

1.3 研究方法

1.3.1 一般指標(biāo)記錄年齡、性別、糖尿病病程，男性是否吸煙，男性是否飲酒（注：所有女性患者均不吸煙，不飲酒）。測(cè)試當(dāng)日由專人用固定體重/身高測(cè)量?jī)x測(cè)定：體重、身高、計(jì)算體重指數(shù)（BMI），單位kg/m2。

1.3.2 血壓指標(biāo)采用汞柱式標(biāo)準(zhǔn)袖帶血壓表，休息5分鐘后測(cè)定坐位右上臂收縮壓（SBP）/舒張壓（DBP），單位mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。

1.3.3 其他生化指標(biāo)受試者隔夜禁食8～12 h，清晨取靜脈血測(cè)空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、肝腎功能電解質(zhì)（血鈣）、血脂、尿酸（UA）、維生素D濃度、雌激素水平、睪酮水平，超敏C反應(yīng)蛋白（Hs-CRP）、纖維蛋白原（FIB）。按標(biāo)準(zhǔn)方法行OGTT試驗(yàn)，檢測(cè)OGTT-0 h、2 h血糖，采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定0 h、2 h胰島素（INS）水平（單位：mIU/L）。再采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）：HOMA-IR=FINS X FPG/22.5，F(xiàn)INS單位為mIU/L，F(xiàn)PG即OGTT-0 h，單位為mmol/L。低的HOMA-IR示高胰島素敏感性，而高的HOMA-IR表示胰島素敏感性差，存在胰島素抵抗。

1.3.4 外周血基因組DNA提取空腹采集靜脈血6～8 mL，EDTA抗凝，-80 ℃保存，標(biāo)本收集結(jié)束后購(gòu)進(jìn)DNA提取試劑盒統(tǒng)一提取VDR基因。所需試劑及儀器為：DNA提取試劑盒，購(gòu)于AXYGEN公司；DNA聚合酶（2×Taq Master Mix）購(gòu)于Bioteke公司，引物由昆明碩擎公司合成；普通PCR儀購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（型號(hào)ABI2720）；各種規(guī)格的離心管、槍尖、PCR管、一次性乳膠手套和口罩購(gòu)于NSET公司。

1.3.5 PCR擴(kuò)增（1）擴(kuò)增所使用的引物（Bsm I位點(diǎn)）：上游引物5′-GAACCAAGACTACAAGTACC GCGTCAGTGA-3′；下游引物5′-TGGCGGCAGCG GATGTACGTCTGC-3′；（2）PCR反應(yīng)體系：25 μL混勻液體。包括2XTaq PCR Master Mix 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μM，碩 擎）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μM，碩擎）1 μL，Template DNA 4 μL，Nuclease-freeWater 8.5 μL；（3）PCR反應(yīng)條件：共35個(gè)循環(huán)，95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，反應(yīng)完成后，72 ℃再延伸10 min；（4）酶切鑒定基因型：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用BsmⅠ酶酶切后，置于2%瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。

1.3.6 骨密度測(cè)量采用通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)的雙能X線骨密度儀（型號(hào)DPX Bravo）測(cè)量腰椎L1～L4、股骨頸、髖部骨密度及T值評(píng)分（BMD），單位g/cm2。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究的所有數(shù)據(jù)均使用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)基因型的分布是否具有代表性。正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3個(gè)獨(dú)立樣本比較，采用方差分析，組間比較用最小有意義差異法（LSD檢驗(yàn)）。非正態(tài)分布計(jì)量資料用（MP25，P75）表示，采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多因素Logistic回歸分析篩選獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組人群一般資料比較

3組人群一般資料比較，結(jié)果顯示：3組患者性別、年齡、吸煙、飲酒、DBP、身高、體重、BMI、HDL-C、雌激素、睪酮差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且在T2DM伴骨質(zhì)疏松組與無(wú)骨質(zhì)疏松組比較時(shí)，上述指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象的一般資料比較[，M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of general data of study subjects [，M（P25，P75）]

表1 研究對(duì)象的一般資料比較[，M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of general data of study subjects [，M（P25，P75）]

總體比較：*P＜0.05，兩兩比較：與無(wú)骨質(zhì)疏松組比較，#P＜0.005，；與合并骨量減少組比較，&P＜0.05。

2.2 VDR基因型及等位基因頻率分布情況

2.2.1 VDR基因型酶切電泳圖結(jié)果顯示：VDR基因經(jīng)Bsm I酶酶切后對(duì)應(yīng)的基因型有3種：純合子BB 型825 bp一條帶；雜合子Bb 型825 bp、675 bp、150 bp三條帶；純合子bb 型675 bp、150 bp兩條帶，見(jiàn)圖1。

圖1 VDR基因型酶切電泳圖Fig.1 VDR genotypes enzyme electrophoresis figure

2.2.2 VDR基因型分布情況VDR基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，說(shuō)明所選人群代表性好.在237例人群中，VDR基因型分布情況為：BB型31例，占13.1%，Bb型184例，占77.6%，bb型22例，占9.3%。提示昆明地區(qū)糖尿病患者中，VDR基因型以Bb型為主。

2.2.3 3組人群VDR基因型分布頻率比較結(jié)果顯示：3組人群VDR基因型BB，Bb，bb基因型比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=6.456，P=0.168），見(jiàn)表2。

表2 VDR基因型分布頻率比較[n（%）]Tab.2 Comparison of VDR genotypes distribution frequency [n（%）]

2.2.4 3組人群VDR等位基因分布比較3組人群VDR等位基因B、b的分布頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=1.953，P=0.162），見(jiàn)表3。

表3 VDR等位基因分布頻率比較Tab.3 VDR allele frequency distribution

2.2.5 VDR基因多態(tài)性與2型糖尿病患者BMD的關(guān)系結(jié)果顯示：237例T2DM患者中，VDR不同基因型在各部位的BMD值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 VDR基因多態(tài)性與2型糖尿病患者BMD的關(guān)系[（g/cm2），（）]Tab.4 The relationship between the VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients [（g/cm2），（）]

表4 VDR基因多態(tài)性與2型糖尿病患者BMD的關(guān)系[（g/cm2），（）]Tab.4 The relationship between the VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients [（g/cm2），（）]

2.3 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

將VDR基因型（1為BB型，2為Bb型，3為bb型）及單因素分析3組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量，即性別（0為女，1為男）、年齡、吸煙（0為無(wú)，1為有）、飲酒（0為無(wú)，1為有）、DBP、身高、體重、BMI、HDL-C、雌激素、睪酮作為因變量，糖尿病有無(wú)骨質(zhì)疏松作為自變量（0為無(wú)，1為有），進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，以篩選糖尿病伴骨質(zhì)疏松的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果顯示：年齡（OR1.115、98%CI：1.035～1.202、P=0.004）、吸煙（OR10.318、95%CI：1.637～65.046、P=0.013）可以進(jìn)入回歸方程，見(jiàn)表5。

表5 Logistic回歸分析結(jié)果Tab.5 Logistic analysis results

參考類別說(shuō)明：“VDR基因型”中的BB型，“性別”以女性，“吸煙”以不吸煙，“飲酒”以不飲酒，“糖尿病有無(wú)骨質(zhì)疏松”以糖尿病無(wú)骨質(zhì)疏松作為參考類別。

3 討論

糖尿病患者骨質(zhì)疏松發(fā)病率明顯升高[4]。國(guó)內(nèi)有報(bào)道[5]，近1/3的糖尿病患者可診斷為骨質(zhì)疏松癥。然而，T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，糖尿病高血糖狀態(tài)、糖尿病慢性并發(fā)癥、糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、氧化應(yīng)激損傷、胰島素及胰島素樣生長(zhǎng)因子分泌的減少、炎癥因子（CRP、IL-6等）水平的升高等均可能影響骨代謝[6-8]。另外，年齡、性別、吸煙、體重、生活方式、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、環(huán)境和遺傳等均是重要的影響因素。目前，對(duì)于VDR基因多態(tài)性與2型糖尿病伴骨質(zhì)疏松癥的研究，國(guó)內(nèi)外已有不少報(bào)道，但結(jié)果多有不同。

本研究結(jié)果顯示：從無(wú)骨質(zhì)疏松癥組-骨量減少組-骨質(zhì)疏松癥組，女性占比增多，分別是15例（24.6%），50例（45%），50例（76.9%）；而身高、體重、BMI逐漸下降，提示女性2型糖尿病患者更易患骨質(zhì)疏松；而體重可能是2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松的保護(hù)性因素。但進(jìn)一步Logstic回歸分析顯示：性別、身高、體重、BMI 均未進(jìn)入回歸方程，尚不能說(shuō)明性別、體重是昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松的癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

從無(wú)骨質(zhì)疏松組-骨量減少組-骨質(zhì)疏松癥組，年齡逐漸增加，男性吸煙占比也增大，分別是24例（52.2%），32例（52.5%），11例（73.3%）。進(jìn)一步Logstic回歸分析顯示：年齡、吸煙均進(jìn)入回歸方程，說(shuō)明年齡、吸煙是昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與曹國(guó)磊[9]的研究結(jié)果一致。有研究表明，長(zhǎng)期吸煙可能導(dǎo)致鎘在人體慢性蓄積，鎘的蓄積可以加速骨量丟失，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展[10-11]。

本研究還觀察到，VDR（Bsm I）基因型分布頻率為：BB型13.1%、Bb型77.6%，bb型9.3%，提示昆明地區(qū)T2DM患者VDR（Bsm I）基因型以Bb型為主。在T2DM伴骨質(zhì)疏松患者中，VDR基因型分布頻率為：BB型12.3%、Bb型75.4%，bb型12.3%，提示昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松患者VDR（Bsm I）基因型也以Bb型為主。這與北京[12]、廣州[13]地區(qū)的研究結(jié)果不一致。這可能與VDR基因多態(tài)性在不同地域存在差異有關(guān)。

在2型糖尿病患者中，無(wú)骨質(zhì)疏松組，骨量減少組，骨質(zhì)疏松組3組比較，VDR基因型分布頻率及等位基因頻率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。梁偉對(duì)廣州地區(qū)的漢族人群研究發(fā)現(xiàn)[13]：正常骨量組，骨質(zhì)疏松組，2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松組比較，3種酶（Bsm I，Apa I，Taq I）定義的VDR基因型均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，筆者的結(jié)果與之一致。國(guó)內(nèi)張紅紅[14]的研究也認(rèn)為VDR基因與骨質(zhì)疏松無(wú)關(guān)。國(guó)外Lim等[15]對(duì)荷蘭人群的研究發(fā)現(xiàn)VDR基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松無(wú)關(guān)聯(lián)。Hansen等[16]對(duì)丹麥絕經(jīng)婦女的研究也認(rèn)為VDR基因多態(tài)性不能預(yù)測(cè)該人群的骨密度及骨量丟失。進(jìn)一步按VDR基因型分組比較發(fā)現(xiàn)，不同基因型間不同部位的骨密度數(shù)值也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示VDR基因型可能不是T2DM患者骨密度降低的易感基因。將VDR基因型及單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量作為因變量，糖尿病有無(wú)骨質(zhì)疏松作為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，VDR基因型未進(jìn)入回歸方程，提示VDR基因型尚未增加T2DM人群患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)，VDR（Bsm I）基因型與昆明地區(qū) T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的遺傳易感性無(wú)關(guān)。

綜上所述，T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的影響因素及相關(guān)候選基因較多，單一基因的作用是有限的，基因多態(tài)性在不同國(guó)家、種族、地域也存在較大差異。筆者的研究發(fā)現(xiàn)，年齡，吸煙是T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但未發(fā)現(xiàn)VDR（Bsm I）基因型與昆明地區(qū) T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的遺傳易感性相關(guān)。有待進(jìn)行更加廣泛、深入、大樣本、多種族、多地域、多個(gè)基因的聯(lián)合研究，以為2型糖尿病骨質(zhì)疏松的防治工作提供更多的信息和依據(jù)。