蠟樣芽胞桿菌對(duì)馬鈴薯莖稈降解試驗(yàn)研究

王建鳳 徐粲然 田沛雨 楊 寧 李永國

（1.棗莊市山亭區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 山東棗莊277200；2.清華大學(xué)化學(xué)工程系 北京100084；3.棗莊市山亭區(qū)綠色生態(tài)服務(wù)發(fā)展中心 山東棗莊277200；4.棗莊市農(nóng)業(yè)農(nóng)機(jī)技術(shù)推廣中心 山東棗莊277800）

棗莊市位于山東省南部，屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候，有利于馬鈴薯春秋兩茬栽培，常年種植面積穩(wěn)定在80余萬畝，主要分布在滕州市界河鎮(zhèn)、山亭區(qū)城頭鎮(zhèn)、薛城區(qū)周營鎮(zhèn)、嶧城區(qū)陰平鎮(zhèn)、臺(tái)兒莊區(qū)泥溝鎮(zhèn)，農(nóng)戶種植經(jīng)濟(jì)效益顯著。近年來，棗莊市大力開展國家可持續(xù)試驗(yàn)示范區(qū)創(chuàng)建，實(shí)行農(nóng)業(yè)減肥行動(dòng)，馬鈴薯作為棗莊市重要的糧蔬飼作物，綠色高效栽培技術(shù)不斷被農(nóng)民接受、推廣、應(yīng)用。但是，馬鈴薯收獲后的莖稈成為污染環(huán)境、浪費(fèi)資源的一個(gè)難題，不符合我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。鑒于此，筆者通過土壤環(huán)流馴化裝置，從馬鈴薯種植土壤中篩選與強(qiáng)化，得到對(duì)馬鈴薯莖稈具有快速降解作用的土著微生物菌株，實(shí)現(xiàn)馬鈴薯莖稈的快速腐熟，達(dá)到馬鈴薯莖稈資源化利用，為相同生態(tài)種植區(qū)馬鈴薯莖稈利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

天平用于精確稱量各類試劑及藥品；培養(yǎng)箱主要用于實(shí)驗(yàn)室微生物的培養(yǎng)，為微生物的生長提供一個(gè)適宜的環(huán)境；循環(huán)流化床用于篩選菌株；高壓蒸汽滅菌鍋在進(jìn)行無菌操作前需要將操作器皿、培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌后才能使用，確保達(dá)到無菌；培養(yǎng)皿用于放置培養(yǎng)基，培養(yǎng)微生物，為微生物的繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì)；超凈工作臺(tái)實(shí)現(xiàn)微生物的接種及處理時(shí)的無菌操作。

1.2 微生物培養(yǎng)基配制

一是配制無機(jī)鹽培養(yǎng)基。稱量硫酸銨1.0 g、磷酸氫二鉀0.5 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.2 g，溶解于1000 mL去離子水中，在121℃環(huán)境中滅菌15 min。二是配制LB液體培養(yǎng)基。稱量酵母粉0.5 g、氯化鈉1.0 g、蛋白胨1.0 g，溶解于100 mL去離子水，在121℃環(huán)境中滅菌15 min。三是配制PDA液體培養(yǎng)基。稱量馬鈴薯浸出粉0.3 g、葡萄糖2.0 g，溶解于100 mL去離子水，在121℃環(huán)境中滅菌15 min。

1.3 菌株篩選

2018年11 月，室外采集的土壤樣品，通過土壤環(huán)流馴化法對(duì)所需功能微生物進(jìn)行篩選。稱取200 g土壤與10 g馬鈴薯莖段放入循環(huán)流化床內(nèi)，底部放入4層紗布。將1500 mL經(jīng)過121℃滅菌15 min的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基隨蠕動(dòng)泵抽入流化床，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為170 r/min，氣泵排氣量為2 L/min，每隔一段時(shí)間向流化床中補(bǔ)給培養(yǎng)基溶液。每隔2 d取環(huán)流液100μL，取得樣品分別稀釋102、104、106、108倍，各取100μL分別涂布在LB與PDA固體培養(yǎng)基上，放置在30℃恒溫箱中培養(yǎng)。

從混合菌株中挑取的單一菌落，進(jìn)行劃線分離提純，經(jīng)過多次分離純化后得到單一菌株，剔除生長較慢且易染菌的菌株后，總共篩選得到6個(gè)菌株，其中4株細(xì)菌、2株真菌（圖1）。

圖1 分離純化后的菌株

2 試驗(yàn)驗(yàn)證與菌種鑒定

2.1 試驗(yàn)驗(yàn)證

2019年5 月，選取腐爛程度較低的馬鈴薯莖，切成2.5 cm左右的小段（葉基本腐爛，未加入），放入裝有土壤的50 mL三角瓶中，同時(shí)加入2 mL菌液，用土覆蓋，每個(gè)試驗(yàn)組3次重復(fù)，不加菌的作為空白對(duì)照組。定期補(bǔ)充水分，以維持土壤濕度。7 d后挖出馬鈴薯莖觀察腐熟程度。

圖2（a）為未降解的馬鈴薯莖段，呈鮮綠色，木質(zhì)素外殼與內(nèi)部纖維素連接緊密。7 d后將空白對(duì)照組和分別加入6株供試菌株的試驗(yàn)組中的馬鈴薯莖挖出，用清水沖洗干凈，觀察馬鈴薯莖的降解效果。由圖2（b）可以看出，細(xì)菌對(duì)馬鈴薯莖的腐熟效果較好，真菌P-5和P-6與空白組CK無明顯差別，均只腐熟了一部分馬鈴薯莖內(nèi)部的纖維素。各菌株對(duì)馬鈴薯莖的腐熟程度由高到低依次為：P-2>P-1>P-4>P-3≈P-5≈P-6≈CK。其中，菌株P(guān)-2對(duì)馬鈴薯莖稈的降解效果最好，馬鈴薯莖的內(nèi)部纖維素被完全降解，只剩余部分木質(zhì)素外殼。

2.2 菌種鑒定

對(duì)上述所篩選并分離純化的菌株進(jìn)行了DNA測(cè)序，菌株P(guān)-2為一株蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）。蠟樣芽胞桿菌廣泛存在于空氣、塵埃、土壤、水及植物和腐敗有機(jī)物上，能產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生芽孢，是土壤中的優(yōu)勢(shì)菌，有利于促進(jìn)植物根際生長、提高作物抗病能力等，屬于目前研究比較多的植物根際促生菌。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

從馬鈴薯種植地塊中篩選到一株蠟樣芽胞桿菌的降解菌，該菌株對(duì)馬鈴薯莖稈的降解效果較好，7 d后馬鈴薯莖的內(nèi)部纖維素被完全降解，只剩余部分木質(zhì)素外殼，該菌株的篩選為馬鈴薯莖稈腐熟還田技術(shù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

3.2 討論

3.2.1 為馬鈴薯秸稈綜合利用提供有效支撐 馬鈴薯莖稈腐熟還田技術(shù)能夠推動(dòng)秸稈資源循環(huán)利用和多種生產(chǎn)要素的有效轉(zhuǎn)化，大大加速秸稈的腐爛分解，提高農(nóng)作物秸稈資源化利用效率，推動(dòng)馬鈴薯莖稈肥料化利用，作為一個(gè)主導(dǎo)的方向，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的循環(huán)發(fā)展。

3.2.2 實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的資源化利用 馬鈴薯莖稈腐熟還田技術(shù)可以增加土壤中有機(jī)質(zhì)的含量，改善土壤的理化性質(zhì)，形成更加合理的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)土壤的pH，增加土壤中有益微生物菌群的數(shù)量，增強(qiáng)土壤的蓄水保肥能力，減少化肥的使用量，形成更加健康的土壤，提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色化與生態(tài)化。

3.2.3 有利于建設(shè)美麗宜居鄉(xiāng)村 馬鈴薯莖稈腐熟還田技術(shù)還能夠有效解決馬鈴薯莖稈亂堆放、隨意焚燒問題，減少對(duì)大氣、土壤、水等環(huán)境的污染，有利于馬鈴薯莖稈集中處理，為鄉(xiāng)村環(huán)境整治節(jié)約資金開支，有利于構(gòu)建更加美麗宜居的新鄉(xiāng)村。

3.2.4 創(chuàng)新馬鈴薯莖稈多元開發(fā)方式 蠟樣芽胞桿菌作為馬鈴薯莖稈分解腐熟還田的一種微生物，對(duì)于微生物菌群的識(shí)別需要進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)研究，在大田中開展規(guī)模更大的試驗(yàn)研究，得到更具說服力的結(jié)論，同時(shí)開展菌株的篩選研究，獲取更多種有益微生物菌群；在馬鈴薯莖稈的利用方面，馬鈴薯莖稈分解腐熟還田作為一種方式，需要肥料化、飼料化等更多利用方式的結(jié)合，最終達(dá)到綜合高效的利用效果。

3.2.5 做好莖稈還田配套技術(shù)措施 在馬鈴薯莖稈腐熟還田過程中，莖稈腐熟要充分、徹底，保證能夠徹底殺滅病菌，防止肥料帶菌帶毒入地。如開展馬鈴薯莖稈直接還田，需要做好相關(guān)的配套技術(shù)措施，增施微生物菌劑，調(diào)理土壤殺滅病菌，增加土壤中微生物菌群的數(shù)量，提高作物的產(chǎn)量與品質(zhì)。