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    LncRNA-CWF19L1調(diào)控miR-132-3p抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用研究

    2021-07-29 10:01:52郭杰坤彭小明曾令國
    現(xiàn)代醫(yī)院 2021年5期
    關(guān)鍵詞:充質(zhì)成骨熒光素酶

    郭杰坤 方 向 彭小明 曾令國

    骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是具有自我更新、分化和增殖能力的多功能干細(xì)胞[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化對正常生理條件下的骨發(fā)育和病理條件下的骨修復(fù)起著重要作用[2]。長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)是一種長度超過200個核苷酸的非編碼RNA,在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用[3]。目前研究發(fā)現(xiàn),lncRNAs能調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[4-5]。既往的報道表明,lncRNA-CWF19Ll與嬰兒早發(fā)性小腦共濟(jì)失調(diào)和小腦萎縮有關(guān);發(fā)生lncRNA-CWF19L1突變的胎兒發(fā)現(xiàn)有單側(cè)六指畸形和脊椎畸形[6-8]。由此提示,lncRNA-CWF19L1可能與成骨分化相關(guān)?;谝陨媳尘埃诒狙芯恐?,我們將探討lncRNA-CWF19L1影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的具體機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    主要試劑:成骨誘導(dǎo)液(HyClone公司);ALP、BMP2、Smad2及β-actin抗體(abcam公司);Trizol試劑(Thermo Fisher公司);RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher公司);熒光定量試劑盒(Takara公司);海腎熒光素酶載體、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega公司);骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、茜紅素染色液、堿性磷酸酶檢測試劑盒(廣州賽業(yè)公司)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 ShRNA的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染與Smad抑制劑

    ShRNAs由廣州賽哲生物科技合成。相關(guān)序列如下:

    shRNA-1:

    CWF19L1-shRNA-F1:GATCCGGCTTATCTGATGACCATGTTCAAGAGACATGGTCATCAGATAAGCTTTTTTG;

    CWF19L1-shRNA-R1:AATTCAAAAAAGCTTATCTGA-TGACCATGTCTCTTGAACATGGTCATCAGATAAGCCG。

    shRNA-2:

    CWF19L1-shRNA-F2:GATCCGGTTGTTCCTATTTCT-ACATTCAAGAGATGTAGAAATAGGAACAACTTTTTTG;

    CWF19L1-shRNA-R2:AATTCAAAAAAGTTGTTCCTA-TTTCTACATCTCTTGAATGTAGAAATAGGAACAACCG。

    陰性對照組序列:

    CWF19L1-shRNA-NC-F:GATCCGTTCTCCGAACGT-GTCACGTTCAAGAGACGTGACACGTTCGGAGAA-TTTTTTG;CWF19L1-shRNA-NC-R:AATTCAAAAAATTCTCCGAAC-GTGTCACGTCTCTTGAACGTGACACGTTCGGAGAACG。

    慢病毒轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照制造商的說明進(jìn)行。qRT-PCR檢測shRNA(lncRNA-CWF19L1-shRNA1)的轉(zhuǎn)染效率。由于MAPK抑制劑SB203580可以阻斷TGF-β/Smad通路[9],我們選擇SB203580作為Smad2的抑制劑。

    1.2.2 堿性磷酸酶活性測定

    根據(jù)廠商說明,使用ALP檢測試劑盒檢測ALP活力。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于24孔板中,加入成骨誘導(dǎo)液,誘導(dǎo)14 d。將細(xì)胞裂解液加入到堿性磷酸酶試劑盒新鮮配制的底物中培養(yǎng)30 min,然后 NaOH停止。使用酶標(biāo)儀讀數(shù),吸光度為405 nm。經(jīng)過PBS洗滌兩次后,將收集的細(xì)胞固定10 min,在黑暗環(huán)境中使用BCIP/NBT試劑培養(yǎng)30 min后進(jìn)行ALP染色。

    1.2.3 茜素紅S(ARS)染色及其定量檢測

    將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)28 d。用PBS洗滌后,70%冰酒精固定1 h。使用茜紅素染色液,37 ℃下對細(xì)胞進(jìn)行染色25 min,然后用PBS清洗兩次。在光學(xué)顯微鏡拍攝細(xì)胞圖像,觀察鈣化結(jié)節(jié)并計數(shù)[10]。

    1.2.4 RNA提取及實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

    使用Trizol提取總細(xì)胞總RNA。然后根據(jù)試劑盒說明,使用RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用qRT-PCR檢測lncRNA-CWF19L1、BMP2、ALP、Runx2、smad2和β-actin的mRNA表達(dá)水平。引物序列如下:

    lncRNA-CWF19L1, F: 5’-GCGGATTCGCATTCCCAATTT-3’ and R:5’-CTCCACAAGCCAAGAGGCG-3’;

    BMP2,F: 5’-AGTTCTGTCCCCAGTGACGAGTTT-3’ and R: 5’-GTACAACATGGAGATTGCGCTGAG-3’; ALP, F: 5’-AGATGATGACTCTGAGCCTCCTT-3’ and R: 5’-GATGGGACAGCCTAAACTTGG-3’; Runx2, F: 5’-TTCTCCAACCCACGAATGCAC-3’ and R:5’-CAGGTACGTGTGGTAGTGAGT-3’;

    Smad2, F: 5’-TCACAGTCATCATGAGCTCAAGG-3’ and R:5’-TGTGACGCATGGAAGGTCTCTC-3’;

    β-actin, F: 5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3’ and R: 5’-GTACAACATGGAGATTGCGCTGAG-3’。

    采集CT值,計算2-ΔΔct值,對數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。β-actin作為內(nèi)參。miR-132-3p的表達(dá)量采用標(biāo)準(zhǔn)Taqman MicroRNA分析法(Applied Biosystems)進(jìn)行測量[11]。RNU48作為內(nèi)參。

    1.2.5 蛋白免疫印跡反應(yīng)

    使用RIPA裂解液在冰上對細(xì)胞進(jìn)行裂解。經(jīng)過蛋白提取、蛋白濃度測定、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉等步驟后,加入一抗,在4 ℃條件下過夜孵育。然后在37 ℃下,繼續(xù)二抗體孵育2 h。使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)的相對表達(dá)。

    1.2.6 雙熒光素酶反應(yīng)

    按照制造商的說明進(jìn)行熒光素酶報告分析。將對照組細(xì)胞和實驗組細(xì)胞接種于96孔板中,轉(zhuǎn)染2 d后收集細(xì)胞,清洗,每孔加入100 μL雙熒光素酶試劑盒中的細(xì)胞裂解液。取20 μL的細(xì)胞裂解產(chǎn)物,進(jìn)行目報告基因螢火蟲熒光素酶及內(nèi)參海腎素?zé)晒馑孛笝z測,計算螢火蟲熒光素酶表達(dá)值與內(nèi)參海腎素?zé)晒馑孛副磉_(dá)值之間的比值。

    1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

    數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,每個實驗重復(fù)3次。采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 lncRNA-CWF19L1抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

    建立穩(wěn)定低表達(dá)lncRNA-CWF19L1的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。圖1a所示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染組的lncRNA-CWF19L1顯著降低。堿性磷酸酶染色表明,低表達(dá)lncRNA-CWF19L1的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)14 d后,形成的鈣結(jié)節(jié)增多;茜紅素染色表明,低表達(dá)lncRNA-CWF19L1的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中成骨誘導(dǎo)后21 d,鈣化沉淀物顯著增加(圖1b、1c)。與對照組相比,低表達(dá)lncRNA-CWF19L1組的成骨基因BMP2和ALP的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖1d)。以上說明,lncRNA-CWF19L1抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

    注:a為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染lncRNA-CWF19L1-shRNA后,用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染組和對照組的lncRNA-CWF19L1表達(dá)量。b為轉(zhuǎn)染組和對照組分別在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化第21天進(jìn)行茜素紅染色(ARS)和第14天進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色。c為轉(zhuǎn)染組和對照組在堿性磷酸酶染色和茜素紅染色后的鈣化數(shù)定量。d為用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染組和對照組在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21 d后,成骨相關(guān)基因ALP和BMP2的蛋白表達(dá)量。*P<0.05和**P<0.01

    2.2 lncRNA-CWF19L1調(diào)控miR-132-3p表達(dá)

    為進(jìn)一步探討了lncRNA-CWF19L1調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制,建立穩(wěn)定低表達(dá)miR-132-3p和高表達(dá)miR-132-3p的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(見圖2a)。通過qRT-PCR檢測,相對于對照組,低表達(dá)lncRNA-CWF19L1的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的miR-132-3p表達(dá)量顯著降低,而高表達(dá)lncRNA-CWF19L1的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的miR-132-3p表達(dá)顯著升高(見圖2b)。根據(jù)生物信息學(xué)分析(見圖2c),我們構(gòu)建野生型lncRNA-CWF19L1和突變型lncRNA-CWF19L1熒光素酶報告載體。雙熒光素酶報告結(jié)果表明,過表達(dá)miR-132-3p能顯著提高野生型lncRNA-CWF19L1轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性,而突變型lncRNA-CWF19L1的熒光素酶活性沒有變化(見圖2d)。以上結(jié)果表明lncRNA-CWF19L1直接與miR-132-3p結(jié)合,并促進(jìn)其表達(dá)。

    注:a為qRT-PCR檢測過表達(dá)miR-132-3p組、低表達(dá)miR-132-3p組及對照組在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的miR-132-3p表達(dá)量。b為qRT-PCR檢測過表達(dá)lncRNA-CWF19L組、低表達(dá)lncRNA-CWF19L1組及照組在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miR-132-3p的表達(dá)量。c為熒光素酶報告載體中l(wèi)ncRNA-CWF19L1(wt,野生型)與(mut,突變型)結(jié)合位點序列。d為雙熒光素酶報告結(jié)果。*P<0.05和**P<0.01

    2.3 miR-132-3p通過Smad2調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

    圖3a所示,在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中,Smad2的表達(dá)持續(xù)增高。與對照組相比,過表達(dá)miR-132-3p能抑制Smad2的表達(dá),而低表達(dá)miR-132-3p能提高Smad2的表達(dá)(見圖3b)。根據(jù)Targetscan預(yù)測,Smad2可能是miR-132-3p的下游靶基因(見圖3c)。我們建立野生型Smad2 和突變型Smad2 熒光素酶報告載體驗證miR-132-3p和Smad2之間的相互作用。轉(zhuǎn)染miR-132-3p過表達(dá)載體后,野生型Smad2的熒光素酶活性降低,而突變型Smad2的熒光素酶活性沒有變化(見圖3d),以上表明miR-132-3p直接靶向Smad2并抑制其表達(dá)。此外,降低Smad2表達(dá)能降低成骨基因BMP2和ALP的蛋白表達(dá)量,而在低表達(dá)Smad2并低表達(dá)miR-132-3p的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中,BMP2和ALP的蛋白表達(dá)量有所回升(見圖3e)。在茜素紅染色和ALP染色中,得到同樣的結(jié)果(見圖3f、3g)。圖3e~3g結(jié)果表明,低表達(dá)miR-132-3p能促進(jìn)成骨分化,而低表達(dá)Smad2則抑制了成骨分化??傊陨辖Y(jié)果表明miR-132-3p直接靶向Smad2抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

    注:a為qRT-PCR檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過成骨誘導(dǎo)第0、2、4、6、8天Smad2的表達(dá)量。b為qRT-PCR檢測過表達(dá)miR-132-3p組、低表達(dá)miR-132-3p組及對照組的中Smad2的表達(dá)量。c為熒光素酶報告載體中Smad2(wt,野生型)與(mut,突變型)結(jié)合位點序列。d為雙熒光素酶報告結(jié)果。e為分別構(gòu)建低表達(dá)miR-132-3p組,低表達(dá)Smad2組和低表達(dá)miR-132-3p+Smad2組,分別檢測三組Smad2、BMP2、ALP的表達(dá)量。f為上述三組經(jīng)過成骨誘導(dǎo)14天后的堿性磷酸酶染色圖及經(jīng)過成骨誘導(dǎo)21 d后的茜素紅染色圖。g為上述三組的堿性磷酸酶染色和茜素紅染色后的鈣化量。*P<0.05,**P<0.01

    2.4 lncRNA-CWF19L1通過miR-132-3p調(diào)控smad2抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

    分別構(gòu)建過表達(dá)miR-132-3p組,低表達(dá)lncRNA-CWF19L1組,過表達(dá)miR-132-3p+低表達(dá)lncRNA-CWF19L1組及對照組。低表達(dá)lncRNA-CWF19L1可顯著提高Smad2的蛋白和mRNA表達(dá)水平,而在低表達(dá)lncRNA-CWF19L1和過表達(dá)miR-132-3p的共同作用下,Smad2的蛋白和mRNA的表達(dá)水平有所下降(見圖4a、4b)。為了確定lncRNA-CWF19L1和miR-132-3p在調(diào)節(jié)成骨分化中的協(xié)同作用,使用qRT-PCR檢測BMP2和ALP的表達(dá)水平。如圖4c和4d所示,相對于對照組,過表達(dá)miR-132-3p能降低BMP2和ALP的表達(dá),但在過表達(dá)miR-132-3p和低表達(dá)lncRNA-CWF19L1的共同作用下,BMP2和ALP的表達(dá)有所回升。以上結(jié)果說明,lncRNA-CWF19L1通過調(diào)控miR-132-3p,抑制smad2表達(dá),進(jìn)而抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

    注:分別構(gòu)建過表達(dá)miR-132-3p組,低表達(dá)lncRNA-CWF19L1,過表達(dá)miR-132-3p+低表達(dá)lncRNA-CWF19L1及對照組。a為用western blot檢測以上四組的Smad2蛋白表達(dá)量。b為用qRT-PCR檢測以上四組的Smad2表達(dá)水平。c、d為用qRT-PCR分別檢測上述4組的BMP2和ALP表達(dá)水平。*P<0.05

    3 討論

    目前研究發(fā)現(xiàn),lncRNA參與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。例如,上調(diào)lncRNA-MEG3可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[12],而下調(diào)lncRNA-NONHSAT009968可抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[4]。既往有報道顯示,lncRNA-CWF19Ll與小腦疾病、肝臟炎癥有關(guān);胎兒的lncRNA-CWF19L1表達(dá)異??芍聠蝹?cè)肢體六指畸形和脊椎畸形[6-8]。LncRNA-CWF19Ll可能與成骨分化相關(guān)。然而,lncRNA-CWF19L1影響人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制尚未確定。在本項研究中,我們通過降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-CWF19L1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力有所增強(qiáng)。由此提示,lncRNA-CWF19L1可影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。

    已有研究表明miR-132-3p可負(fù)性調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[13-15]。在本研究中,過表達(dá)miR-132-3p可降低人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Smad2、BMP2和ALP的表達(dá)量;而低表達(dá)miR-132-3p則促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,由此證明miR-132-3p是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的負(fù)性調(diào)控因子[14]。實驗中的雙熒光素酶結(jié)果表明,lncRNA-CWF19L1與miR-132-3p直接相關(guān),過表達(dá)miR-132-3p能提高lncRNA-CWF19L1的熒光素酶活性。同時,低表達(dá)lncRNA-CWF19L1能降低miR-132-3p的表達(dá)量。這些結(jié)果表明lncRNA-CWF19L直接與miR-132-3p結(jié)合,調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。

    目前研究認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化受多種信號途徑調(diào)控,包括TGF-β、BMPs、Wnt、MAPK和Hedgehog等[16];其中TGF-β通路是成骨的重要信號通路之一。Smad2作為是TGF-β信號通路的起始因子,將TGF-β從胞外傳遞到核內(nèi),直接參與TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17-18]。目前有研究表明,Smad2作為miR-132-3p的靶基因,影響MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化[19];而抑制Smad2的表達(dá)能抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[20]。在當(dāng)前研究中,通過TargetScan網(wǎng)站分析,Smad2作為miR-132-3p的下游靶基因,并通過雙熒光素酶實驗驗證了兩者間的靶控關(guān)系。過表達(dá)miR-132-3p能降低Smad2的表達(dá);而抑制了miR-132-3p則增加Smad2表達(dá)。同時,低表達(dá)Smad2能降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中BMP2和ALP的表達(dá)量。鑒于我們已經(jīng)證明miR-132-3p和Smad2對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的調(diào)節(jié)功能,我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),低表達(dá)lncRNA-CWF19L1可降低miR-132-3p的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致Smad2上調(diào),進(jìn)一步增加BMP2和ALP的表達(dá),從而促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。由此,以上結(jié)果闡明了lncRNA-CWF19L1調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)制。

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