PD-1/PD-L1 在胃癌組織中的表達及其臨床意義

鄧 淵，馬云濤

（1.甘肅省人民醫(yī)院普外一科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學甘肅省中醫(yī)藥研究中心，甘肅 蘭州 730000）

胃癌（gastric cancer）是一種起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率居各類腫瘤首位。大部分患者胃癌發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)到中晚期，嚴重影響患者的生命健康，因此急需尋找一種新的診療方案。隨著對胃癌的深入研究，發(fā)現(xiàn)免疫逃逸在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演了非常重要的角色。PD-1 和其配體PD-L1 通路是抑制性免疫檢查點，通過抑制T 細胞的免疫反應，在免疫耐受中發(fā)揮重要作用，從而造成腫瘤細胞免疫逃逸，這也為胃癌的診療提供了一種新的思路。本研究擬通過檢測PD-1、PD-L1 蛋白在胃癌及癌旁標本中的表達，探討PD-1、PD-L1 在臨床中的診療意義，為胃癌的診療工作提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年1 月～12 月甘肅省人民醫(yī)院收治的46 例實施胃癌根治術的胃癌患者作為研究對象，其中男性33 例，女性13 例；年齡35～81歲，平均年齡（58.70±9.05）歲；腫瘤直徑：≤5 cm 39例，＞5 cm 7 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期19 例，Ⅲ～Ⅳ期27 例；分化程度：低分化26 例，中分化18 例，高分化2 例；浸潤分布情況：粘膜及粘膜下層3 例，肌層21 例，漿層22 例；有淋巴結轉移29 例，無淋巴結轉移17 例。納入標準：①經(jīng)病理檢查等確診為胃癌者；②術前未行放化療等抗腫瘤治療者；③未合并其他惡性腫瘤者；④病歷資料完整者。排除標準：①合并嚴重慢性病患者；②胃癌復發(fā)患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 鼠抗PD-1 和兔抗PD-L1 購于福州邁新生物技術有限公司，小鼠抗β-actin 單抗、二抗、DAB 試劑盒、枸櫞酸緩沖液購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SP 免疫組化法檢測胃癌及癌旁組織中PD-1、PD-L1 的表達情況 取胃癌患者的胃癌及其旁組織，經(jīng)4%甲醛固定后制作蠟塊待用。將組織以4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)抗原修復、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、阻斷非特異性反應后，加入PD-1、PDL1 一抗（稀釋比例均為1∶100）后4 ℃孵育過夜，生物素標記二抗孵育后，滴加DAB 顯色劑顯色，蘇木素復染，脫水透明封片。免疫組化結果判定[1]：每張切片中選取癌細胞數(shù)較多的5 個高倍視野（400×），每個視野計數(shù)100 個細胞。按染色強度計分：無陽性著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；按陽性細胞百分比計分：陽性細胞數(shù)＜5%為0 分，6%～30%為1 分，31%～60%為2 分，＞60%為3 分，將兩項得分相加，≥2 分為陽性，＜2 分為陰性。

1.3.2 免疫印跡法檢測胃癌及癌旁組織中PD-1、PD-L1 的表達情況 取胃癌及癌旁組織，經(jīng)RIPA裂解，4 ℃，15000 r/min 離心10 min，取上清，測蛋白濃度，計算上樣量。經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳后，電轉至0.22 mm 的PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。封閉后加入相應濃度的PD-1、PD-L1 抗體，37 ℃孵育2 h，4 ℃過夜；用TBST（TBS 加0.1%吐溫）洗滌PVDF 膜3 次，10 min/次，后加入二抗，置于搖床37 ℃孵育1 h。用TBST 洗膜3 次，常規(guī)曝光顯影。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（）表示，計數(shù)資料以（n）和（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD-1、PD-L1 表達與患者臨床病理特征的關系SP 免疫組化檢測結果顯示，46 例患者胃癌組織中PD-1 蛋白表達陽性率為78.26%（36/46），高于PDL1 的58.70%（27/46），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.079，P＜0.05），見圖1。不同TNM 分期PD-1 表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同年齡、性別、腫瘤直徑大小、分化程度、浸潤分布情況、淋巴結轉移PD-1表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同腫瘤浸潤情況PD-L1 表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移間PD-L1 表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

圖1 PD-1 和PD-L1 在胃癌及癌旁組織中的表達(SP 免疫組化法×400)

表1 胃癌組織中PD-1 和PD-L1 蛋白的表達與臨床病理特征的關系（n）

表1（續(xù)）

2.2 WB 法檢測PD-1 和PD-L1 在胃癌組織中的表達 WB 法檢測顯示，在胃癌細胞中PD-1 和PD-L1均有表達，見圖2。

圖2 PD-1 和PD-L1 在胃癌及癌旁組織中的表達

3 討論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)報道[2，3]，我國的胃癌發(fā)病率最高，胃癌患病人數(shù)約占到了全世界的1/3，其中西北地區(qū)邊遠農(nóng)村的胃癌發(fā)病率及死亡率居全國之首。胃癌的發(fā)病死亡率較高，5 年生存率不足40%，這主要就是因為許多患者發(fā)現(xiàn)胃癌時多數(shù)已是晚期，早期胃癌的檢出率不到10%；如果患者能在胃癌僅限于胃壁的黏膜層時檢出并進行治療，5 年的生存率可達95%，因此早期發(fā)現(xiàn)并及時治療對改善胃癌患者預后具有重要意義[4，5]，因此急需尋求高度特異性、高度靈敏的胃癌診斷標志物。

PD-1 是CD28 免疫球蛋白超家族中的一名成員，是一種重要的免疫抑制分子。PD-1 主要表達于T 細胞、B 細胞及NK 細胞的表面，在維持淋巴細胞穩(wěn)態(tài)方面起關鍵作用[6]。PD-L1 是PD-1 的配體，是B7 家族中的成員之一，由IgC 型胞外結構域、跨膜區(qū)及一個短胞質(zhì)區(qū)尾部組成，主要表達于成熟的巨噬細胞、T 細胞、樹突細胞、單核細胞等[7]。正常情況下，PD-L1 與PD-1 結合后，通過調(diào)控T 細胞的增殖與活化，抑制淋巴細胞增殖并誘導其凋亡，從而在自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用[8]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與人體的免疫功能密切相關，正常情況下，免疫系統(tǒng)能夠識別并通過免疫機制特異地清除這些“非己”細胞，抵御腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是在某些情況下，腫瘤細胞能通過多種機制逃避機體免疫系統(tǒng)的識別，在體內(nèi)迅速增殖，即腫瘤免疫逃逸機制[9]。研究表明[10]，PD-L1 與PD-1 結合可引起免疫細胞功能障礙，誘導免疫耐受，發(fā)揮負性免疫調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)為中性粒細胞的吞噬功能降低，DC 抗原提呈能力下降，NK 細胞增殖、分泌功能受損，T、B 細胞凋亡增加，Treg 數(shù)量增加。PD-L1 與PD-1 分子結合后會影響共刺激信號的傳遞，抑制抗原提呈細胞對T、B 細胞的活化，發(fā)揮免疫抑制作用，而T 細胞表面PD-1 與腫瘤表面表達的PD-L1結合后，可抑制T 細胞的增殖和活化，觸發(fā)免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的免疫耐受，促進腫瘤生長[11-14]。目前很多研究表明PD-1 和PD-L1 在多種惡性腫瘤中均有高表達，但是對于不同的腫瘤，PD-1 和PD-L1的表達與其臨床指征并不完全一致[15.16]。本研究通過對46 例胃癌患者的胃癌組織和癌旁組織進行檢測發(fā)現(xiàn)，46 例患者胃癌組織中PD-1 蛋白表達陽性率為78.26%（36/46），高于PD-L1 的58.70%（27/46），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且不同TNM 分期PD-1 表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同腫瘤浸潤情況PD-L1 表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與李雪薇[17]研究結果相一致；同時，WB 法檢測顯示，在胃癌細胞中PD-1 和PD-L1 均有表達，提示PD-1 表達與TNM 分期有關，PD-L1 表達與腫瘤浸潤情況有關，二者可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，并可能作為胃癌的一個潛在治療靶點。

綜上所述，PD-1 和PD-L1 在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到了一定的作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關，已成為胃癌腫瘤研究中的重要因子，有望成為胃癌篩查及診療的重要標志物，在腫瘤侵襲轉移的評估、預后判斷和治療方面有著廣闊的臨床應用前景。