鐵皮石斛葉多糖的提取及其免疫活性測定

韓娟娟,陳舜勝,劉克海

鐵皮石斛葉多糖的提取及其免疫活性測定

韓娟娟,陳舜勝,劉克海*

上海海洋大學(xué)食品學(xué)院, 上海 201306

應(yīng)用響應(yīng)面法對鐵皮石斛葉多糖的提取進行優(yōu)化，并對多糖初步純化。將鐵皮石斛葉多糖作用于脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人體單核細(xì)胞（THP-1），測定對THP-1細(xì)胞活性及活性氧（ROS）形成的影響，以研究其免疫活性。結(jié)果表明：鐵皮石斛葉多糖的最佳提取工藝為溫度70.61 ℃、時間1.96 h、料液比20:1，此時多糖得率可達(dá)13.56%，與理論預(yù)測值基本吻合。利用透析袋除去多糖中小分子雜質(zhì)，經(jīng)凝膠柱Sephadex G-100初步純化，獲得一種純化多糖，即命名為DLP。將DLP作用于THP-1，隨著濃度增大(0.5～100 μg/mL)，DLP能劑量依賴性地抵抗LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞毒；5 μg/mL時，THP-1細(xì)胞活性基本完全接近對照組。此外，5 μg/mL鐵皮石斛葉多糖可有效抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。因此，采用響應(yīng)面法提取并經(jīng)凝膠柱純化得到的鐵皮石斛葉多糖具有良好免疫活性。

鐵皮石斛; 多糖; 響應(yīng)面; 流式細(xì)胞儀; 免疫活性

鐵皮石斛（KimuraMigo）作為珍貴傳統(tǒng)中藥材，民間所謂的“楓斗”即為其莖卷曲后烘干制得，隸屬于蘭科石斛屬，是多年生草本植物，主要分布于我國云南、貴州等地[1]。鐵皮石斛味甘、性微寒，具有生津養(yǎng)胃、退熱潤肺、滋陰補益之功效[2]，活性成分主要為多糖、石斛堿、氨基酸及多種揮發(fā)性成分[3]，其中，多糖是其主要成分，具有抗氧化、抗炎和提高免疫等作用，是理想的藥物和保健食品基料[4,5]。此外，鐵皮石斛在東南亞還用作食物。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對鐵皮石斛的研究主要集中在莖稈部分，而對其葉研究較少。有研究對鐵皮石斛莖、葉多糖含量及結(jié)構(gòu)進行比較，二者具有相同多糖成分，葉多糖含量約為莖的1/3[6]，可見石斛莖和葉在功效上具有相似性。然而作為非藥用部分的鐵皮石斛葉尚未充分開發(fā)利用，近年來僅僅被用作茶飲，這是對珍貴石斛資源的浪費。因此，鐵皮石斛葉的開發(fā)利用亟待解決，其多糖的有效提取是關(guān)鍵。目前石斛葉多糖的提取及優(yōu)化方法報道較少，且大多采用正交試驗設(shè)計，不能在整體范圍內(nèi)找到因素的最佳組合。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化鐵皮石斛葉多糖的提取[7]，并進一步純化，同時對其免疫活性進行評價[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛葉購買于浙江省溫州市。THP-1細(xì)胞由中科院提供。

石油醚、苯酚和二甲基亞砜均為分析純。96孔板及培養(yǎng)瓶均是無菌。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；冷凍干燥機（LABCONCO）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）；酶標(biāo)儀(CORONA)；細(xì)胞房無菌操作臺

1.3 試驗方法

1.3.1 石斛葉多糖的提?。?）石斛葉多糖提取的工藝步驟[9]鐵皮石斛葉干品→粉碎機粉碎→脫脂→溫水浸提→真空抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→85%乙醇沉淀過夜→離心→冷凍干燥→鐵皮石斛多糖。

（2）石斛葉多糖提取工藝優(yōu)化研究表明，提取時間、溫度、料液比和提取次數(shù)對鐵皮石斛提取率會有顯著影響[10]，因此實驗首先選擇上述因素進行單因素實驗分析，依據(jù)其結(jié)果，進而選擇提取溫度、提取時間和料液比三因素及三水平，以石斛葉多糖得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化石斛葉多糖提取工藝，實驗設(shè)計詳見表1[11]。根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果，進行加標(biāo)回收率試驗。

表1 鐵皮石斛葉多糖提取響應(yīng)面分析的因素水平

1.3.2 石斛葉多糖的純化透析袋剪成約10 cm的小段，煮沸處理后，一端用橡皮筋扎緊，將透析袋灌滿水，即可加入多糖樣品，放置過夜除去小分子雜質(zhì)[12]。稱取15 g左右的Sephadex G-100溶脹漂洗后濕法裝柱，之后用0.1 mol/L NaCl溶液平衡24 h，平衡完畢后用0.1 mol/L NaCl溶液溶解干燥好的樣品，制成50 mg/mL的石斛葉多糖濃度由上端進樣，以0.3 mL/min的速度進行洗脫，15 min每管，苯酚-硫酸法隔管跟蹤檢測收集，直至無多糖檢出為止，繪制洗脫曲線，合并各洗脫組分，蒸發(fā)濃縮，透析除去NaCl，冷凍干燥得到多糖[13]。

1.3.3 鐵皮石斛葉多糖的含量測定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確稱取干燥的D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，蒸餾水定容至100 mL作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)D-葡萄糖溶液0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、4、4.8 mL，移入帶刻度的試管中，定容至4 mL，同時做空白對照。然后，分別加入1 mL 5%重蒸苯酚溶液，混合均勻后，快速加入95%硫酸溶液5 mL，室溫放置20 min，在490 nm波長下進行比色。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]，得到線性回歸方程為=1.3428+0.0005，相關(guān)系數(shù)2=0.9916，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）鐵皮石斛葉多糖的含量與提取率 采用改良的苯酚-硫酸法[15]，在490 nm處測定鐵皮石斛葉多糖含量。

多糖提取率/%=多糖干品質(zhì)量/石斛葉質(zhì)量×100%。

1.3.4 石斛葉多糖的免疫活性（1）細(xì)胞培養(yǎng) 人體單核細(xì)胞THP-1(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供)培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞長至80%～90%時傳代，選擇對數(shù)生長期狀態(tài)進行實驗。

（2）細(xì)胞活性測定（MTT法）通過MTT實驗測定細(xì)胞活性[16]。即，調(diào)整THP-1細(xì)胞濃度為每毫升1×105個，接種于96孔板，孵化過夜后，添加1 μg/mL的LPS或DLP（終濃度10、30、50和100 μg/mL）處理細(xì)胞，設(shè)置陽性對照組。培養(yǎng)24 h后清洗細(xì)胞，并添加含有5 μg/mL MTT的無血清RPMI-1640。棄去培養(yǎng)基，二甲基亞砜溶解藍(lán)色沉淀，于550 nm測定光密度。

（3）細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測[17]培養(yǎng)細(xì)胞濃度為每毫升1×105個，轉(zhuǎn)移至24孔板，然后每孔分別添加1 μg/mL LPS和5 μg/mL DLP，37 ℃培養(yǎng)過夜后，磷酸緩沖鹽溶液清洗兩次，裝載H2DCFDA探針，孵化30 min后收集細(xì)胞于EP管。利用流式細(xì)胞儀測定各管中細(xì)胞樣品的熒光值，反映胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對鐵皮石斛葉多糖得率的影響選擇80 ℃提取2次，每次1 h，考察料液比對多糖提取率的影響，分別設(shè)定為20:1、30:1、40:1、50:1、60:1，結(jié)果如圖2。

由圖2可知，對于鐵皮石斛，隨著料液比的增大，在20～30 mL/g時，多糖提取率顯著升高，在40 mL/g時，有明顯降低，之后隨著料液比的增大，提取率有回升，但沒有超過30 mL/g時的提取率。綜合經(jīng)濟成本因素，初步選取20～30 mL/g作為提取時的料液比。

2.1.2 提取時間對石斛葉多糖提取率的影響選定30 mL/g的物料比，在80 ℃提取2次，考察時間對石斛葉多糖提取率的影響，分別設(shè)定為1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，結(jié)果如圖3。

圖2 料液比對多糖提取率的影響

圖3 時間對石斛葉多糖提取率的影響

由圖3可看出，當(dāng)提取次數(shù)固定時，在1.5～3 h內(nèi)，當(dāng)延長提取時間，多糖的提取率的增大是極顯著的，而在1 h和3.5 h處均較低，考慮時間和機器運轉(zhuǎn)成本，因此，初步選擇1.5～2.5 h做為提取時間的設(shè)定。

2.1.3 提取次數(shù)對石斛葉多糖得率的影響選定30 mL/g的物料比，80 ℃提取2 h，考察提取次數(shù)對石斛葉多糖提取率的影響，分別為1、2、3、4、5次，結(jié)果如圖4。

由圖4可知，不斷增加提取次數(shù)，多糖得率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，且達(dá)到2次時，多糖的提取速率增加最大，超過兩小時，提取率增加變緩，故選定提取2次。

2.1.4 溫度對石斛葉多糖提取率的影響選定30 mL/g的物料比，每次提取2 h，共2次，考察溫度對石斛葉多糖提取率的影響，分別設(shè)定為40、50、60、70、80、90 ℃，結(jié)果如圖5。

圖4 提取次數(shù)對石斛葉多糖提取率的影響

圖5 溫度對石斛葉多糖得率的影響

由圖5可知，40 ℃時多糖提取率最低，當(dāng)溫度不斷升高，多糖提取率相應(yīng)增加，達(dá)到80 ℃時，多糖得率有回落，因此，選取70 ℃左右來提取多糖。

2.2 鐵皮石斛葉多糖提取工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面（BBD法）分析采用響應(yīng)面分析，制定提取方案，并經(jīng)由Design Expert8.0.6處理數(shù)據(jù)，如表2所示。

表2 RSM試驗的因素與水平組合和響應(yīng)值

表3 石斛葉多糖提取回歸模型方差分析

注: *表示差異顯著 (<0.05)；**表示差異極顯著(<0.01)

Note: *< 0.05; **< 0.01

對表2的數(shù)據(jù)建立多元回歸擬合,得到石斛葉多糖提取的擬合方程為:

=12.76+0.63-0.18-0.93+1.24-0.07+0.40-1.762-0.652-0.12

對模型進行方差分析(表3)，可以看出:模型=0.0054<0.05,，表明模型顯著；失擬=0.4264，表明失擬不顯著，因此所選用的提取回歸模型是合適的；對多糖提前回歸方程的系數(shù)進行顯著性檢驗，得出模型一次項A(0.05)差異顯著，表明溫度對鐵皮石斛葉多糖得率作用顯著，而模型一次項C(<0.01)差異極顯著，表明料液比對多糖得率的影響極顯著，同時提取時間對多糖得率的影響不顯著。因此，對石斛葉多糖得率影響大小順序為料液比>提取溫度>時間。

2.2.2 鐵皮石斛葉多糖的響應(yīng)面分析利用軟件Design-Expert 8.0.6處理得到3D圖和等高線圖，可直觀地反映出各兩因素交互作用對多糖得率的影響。對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面如圖6所示。

圖6 各兩因素相互作用對石斛葉多糖提取率的影響

從圖6可知，各試驗因素交互作用影響不顯著。試驗因素中料液比對鐵皮石斛葉多糖提取率影響極顯著，同時，提取溫度對鐵皮石斛葉多糖提取率有顯著影響，對回歸模型求解方程，得到最優(yōu)提取操作為提取溫度70.61 °C，提取時間1.96 h，料液比30:1，此時多糖理論得率為13.7195%?？紤]到實驗的可操作性與各因素對得率的影響大小，且過量的提取液將增加濃縮環(huán)節(jié)工作量，工藝參數(shù)擬定為70.61 ℃，時間1.96 h，料液比20:1，測定吸光值，多糖平均得率為13.56%。與理論預(yù)測值基本吻合。因此，利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的鐵皮石斛葉多糖提取工藝實用可靠。

2.2.3 加標(biāo)回收率實驗稱取干燥的鐵皮石斛葉10 g，設(shè)置4個處理組，依次加入一定量的葡萄糖對照品，按照最佳提取條件，制備鐵皮石斛葉溶液，測定吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出多糖得率及加標(biāo)回收率。結(jié)果平均回收率為98.33%，RSD為0.79%。

2.3 鐵皮石斛葉多糖純化

如圖7所示，鐵皮石斛葉多糖經(jīng)透析袋除去小分子雜質(zhì)，Sephadex G-100凝膠柱洗脫后可以分得2個峰，分別簡稱為DLP-Ⅰ和DLP-Ⅱ，其中DLP-Ⅰ的含量較少不予收集，僅收集組分2，命名為DLP。

圖7 鐵皮石斛葉多糖在Sephadex G-100柱的洗脫曲線

2.4 鐵皮石斛葉多糖免疫活性

2.4.1 鐵皮石斛葉多糖對THP-1細(xì)胞活性的影響結(jié)果顯示（圖9），在0.5～100 μg/mL范圍內(nèi)，隨著樣品濃度增大，DLP對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞毒的保護作用呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)濃度為5 μg/mL時，細(xì)胞活性基本完全接近對照組，之后隨著石斛葉多糖濃度的增大，增大作用趨近平行。因此，選取5 μg/mL的多糖濃度作為進一步的免疫活性實驗。

2.4.2 DLP對 THP-1 細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響用熒光探針標(biāo)記THP-1后，測定活細(xì)胞內(nèi)熒光強度以反映ROS的產(chǎn)生量。圖10顯示，1 μg/mL的LPS處理組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強度顯著提高。與陽性對照組相比，5 μg/mL的DLP處理組細(xì)胞內(nèi)ROS形成顯著降低。因此，5 μg/mL鐵皮石斛葉多糖可有效抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。

圖9 鐵皮石斛葉多糖對細(xì)胞活性的影響

圖10 鐵皮石斛葉多糖對活性氧形成的影響

3 討 論

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，雖然料液比對得率有極顯著影響，最佳范圍在20～30，繼續(xù)加大料液比對提取率的提升不明顯，可能是由于這樣會加大藥材在介質(zhì)間的間隙，反而削弱了提取器對藥材組織的攪拌、破碎作用，在保證達(dá)到提取溫度的前提下，適當(dāng)減小料液比也能獲得較好的提取效果。提取溫度對提取率具有顯著的影響，但過高的提取溫度可能會對多糖的良好活性具有一定的損害，因此，保證適宜的提取溫度，適當(dāng)減小料液比可有利于后續(xù)的濃縮操作。

通過上述工藝提取所得鐵皮石斛葉多糖經(jīng)過脫蛋白、透析除去小分子雜志，再經(jīng)過葡聚糖凝膠柱Sephadex G-100，根據(jù)分子量大小的不同，在凝膠柱上受到阻滯作用不同，可將不同分子量階段的多糖組分分離開來，主要成分顯示一個尖銳、細(xì)長的對稱峰，此時獲得的純多糖再進行細(xì)胞免疫活性分析，相對于粗多糖更具科學(xué)性。

鐵皮石斛葉多糖的體外免疫活性實驗結(jié)果表明，在0.5～100 μg/mL范圍內(nèi)，隨著多糖濃度增大，DLP對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞毒的保護作用呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)濃度為5 μg/mL時，細(xì)胞活性基本完全接近對照組，因此鐵皮石斛葉多糖可抵抗脂多糖（LPS）引起的細(xì)胞毒。此外，鐵皮石斛葉多糖可有效抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。體外免疫活性實驗表明鐵皮石斛葉多糖具有較好的免疫活性，為今后鐵皮石斛葉多糖相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了一定的參考和依據(jù)。

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Extraction of Polysaccharide from the Leaves ofand Its Immunomodulatory Property

HAN Juan-juan, CHEN Shun-sheng, LIU Ke-hai*

201306,

Response surface methodology was utilized to optimize the extraction process of polysaccharide from, and the polysaccharide was preliminarily purified. The immunomodulatory property wasevaluated by investigating effects of the polysaccharide on the cell viability and reactive oxygen species (ROS) formation in lipopolysaccharide (LPS) induced- human monocytic cells (THP-1). The optimum condition for the extraction of polysaccharide was found to be at 70.61 ℃ for 1.96 h with a material/solvent ratio of 1:20 (g/mL). Under this condition, the measured values of polysaccharide yield was 13.56%, which was in agreement with the predicted value. The polysaccharide was purified by dialysis bag and Sephadex G-100, and the purified polysaccharide was named DLP. With DLP concentration increasing (0.5～100 μg/mL), DLP could protect against LPS-induced cell toxicity in dosage, as well as inhibit reactive oxygen species (ROS) formation of THP-1. At 5 μg/mL, the activity of THP-1 cells was almost completely close to the control group. These findings suggest that DLP extracted using Response surface method and purified by Sephadex G-100 had good immunomodulatory property.

; polysaccharides; response surface methodology; flow cytometry; immunomodulatory property

S567.239

A

1000-2324(2021)03-0436-07

2016-12-14

2016-12-23

上海市教育委員會重點學(xué)科建設(shè)項目(J50704)

韓娟娟(1990-),女,碩士,研究方向:功能性食品. E-mail:jjhan1409@163.com

Author for correspondence. E-mail:khliu@shou.edu.cn