無患子不同器官中的總皂苷和總黃酮含量

徐圓圓，周思維，陳 仲，趙國春，劉濟銘，王立憲，王 昕，賈黎明*，張端光

(1. 北京林業(yè)大學林學院，省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，國家能源非糧生物質(zhì)原料研發(fā)中心，北京 100083；2. 福建源華林業(yè)生物科技有限公司，福建 建寧 354500)

植物的活性成分主要集中在部分組織器官中[1-4]，這些器官是人們采收和利用的主要部位，而植物其他器官通常會被丟棄，這無疑造成了資源的浪費。對植物不同器官中活性成分的分布和積累進行系統(tǒng)研究，可以幫助人們充分利用植物資源。近年來，科研工作者已對牛膝(Achyranthusbidentata)[5]、三七(Panaxnotoginseng)[6]、遠志(Polygalatenuifolia)[7]中的皂苷和北柴胡(Bupleurumchinense)[8]、青錢柳(Cyclocaryapaliurus)[4]、光果甘草(Glycyrrhizaglabra)[9]、沙棘(Hippophaerhamnoides)[10]中的黃酮在其體內(nèi)各器官中的分布進行了研究。此外，研究還發(fā)現(xiàn)植物的活性成分在不同器官間或不同活性物質(zhì)間可能存在著某些聯(lián)系，如三花龍膽(Gentianatriflora)中的龍膽苦苷和可溶性糖含量呈負相關(guān)[11];黃秋葵(Abelmoschusesculentus)中的花青素和總黃酮含量間表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系[12]，而三七紫、綠莖植株不同營養(yǎng)器官及其總皂苷和總花色苷的含量間也具有一定的相關(guān)性[6]。

無患子(Sapindusmukorossi)為無患子科(Sapin-daceae)無患子屬(Sapindus)落葉喬木，主要分布于我國東部、南部至西南部及日本、朝鮮、中南半島和印度等地[13-14]，是我國傳統(tǒng)的洗護用植物和藥用植物，其根、樹皮、葉、果皮、種仁等均可入藥，具有清熱、祛痰、消積、殺蟲等功效[15-16]。無患子的主要活性成分是三萜皂苷，主要存在于果皮中(4.14%～27.04%)[17-19]；此外，研究發(fā)現(xiàn)無患子根、花等器官中也含有三萜皂苷[20-21]。除三萜皂苷外，Zikova等[22]和Shah等[23]還從無患子的葉和樹皮中提取到了黃酮類化合物。目前，對無患子的主要利用部位為果實，人們對其他器官的研究和利用極少，而且有關(guān)無患子皂苷和黃酮在不同器官中的含量及其相關(guān)性方面的研究鮮見報道。鑒于此，本研究對無患子葉、花、果、枝、根中的總皂苷和總黃酮含量進行測定，揭示總皂苷和總黃酮在植株中的分布情況及其在葉中的動態(tài)積累規(guī)律，并探討其在不同器官間的相關(guān)關(guān)系，以期為無患子的綜合高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于福建省建寧縣源華林業(yè)生物科技有限公司的無患子種植園(116°52′E, 26°49′N)，海拔300 m。該地區(qū)屬亞熱帶海洋性季風氣候，同時兼有大陸性山地氣候的特點，年平均日照時長1 721 h，3—11月(生長季)降雨量1 765 mm，年均氣溫17.0 ℃，年最低氣溫-1.0 ℃；土壤為砂質(zhì)黏壤土，土壤肥力中等，pH 5.1。該種植園采用實生苗造林，樹齡10 a，林分平均樹高6.0 m，平均胸徑12.5 cm，單株平均年產(chǎn)量20 kg。

1.2 植物材料

于2019年4—11月進行試驗材料采集。采用隨機區(qū)組設(shè)計，單株小區(qū)，3次重復。在林分中選取3株樹體相近、生長健康、結(jié)果量穩(wěn)定的無患子優(yōu)樹進行采樣。分別于展葉期(4月30日，L1)、花蕾期(5月11日，L2)、盛花期(6月2日，L3)、初果期(7月8日，L4)、子葉生長期(8月1日，L5)、果實膨大期(9月5日，L6)、果實轉(zhuǎn)色期(10月8日，L7)、果實成熟期(11月6日，L8)等8個生長關(guān)鍵時期采集葉片；于花蕾期、盛花期分別采集花苞(F1)和花朵(F2)；于果實成熟期采集果實[分解為果皮(P)、種皮(SC)、種仁(SK)]、枝(當年生枝，B)和根(須根，R)。葉、花、果實和枝樣品從每棵樹樹冠外圍中上部的東、南、西、北4個方向上隨機摘??；根樣品從距離樹干50～100 cm的東、南、西、北4個方向上隨機挖??；將1棵樹上采集的樣品混合，作為1個生物學重復。樣品采集后，立即帶回實驗室，用蒸餾水清洗干凈后，擦干，裝入信封置于烘箱中，40 ℃下烘至質(zhì)量恒定，然后使用球磨儀粉碎，備用。

1.3 相關(guān)指標的測定

1.3.1 主要儀器、試劑與對照品

Lambda 35紫外可見分光光度計(美國Perkin Elmer公司)；NB5200型超聲波儀(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；Soxtec 8000索氏提取儀(丹麥Foss公司)；MM400球磨儀(德國Retsch公司)；Hei-VAP Precision旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)。試劑和藥品有甲醇、乙醇、正丁醇、冰醋酸、乙酸乙酯、石油醚、高氯酸、濃鹽酸、香草醛、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等，均為分析純，購自現(xiàn)代東方(北京)科技發(fā)展有限公司；對照品齊墩果酸(純度≥98%)、蘆丁(純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3.2 總皂苷含量的測定

總皂苷含量采用香草醛-高氯酸比色法進行測定[24]。準確稱取400 mg樣品，置于索氏提取器中，加入60 mL石油醚，于105 ℃下提取1.5 h，棄去石油醚，待石油醚揮干，加入90 mL 95%(體積分數(shù))乙醇，于130 ℃下提取4.5 h。提取物使用蒸餾水進行溶解，經(jīng)水飽和正丁醇萃取、揮干；甲醇溶解后，加入35%(體積分數(shù))鹽酸置于沸水浴回流酸水解2 h，而后將液體揮干；蒸餾水溶解，乙酸乙酯萃取，揮干；使用甲醇定容至10 mL，稀釋10倍后，進行皂苷含量測定。取0.4 mL待測液于試管中，沸水浴揮干，依次加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸，充分搖勻后于70 ℃水浴加熱15 min，冰浴2 min，然后加入5 mL冰醋酸，搖勻后，測定547 nm處吸光度值，每個樣品重復3次。以齊墩果酸對照品溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：

y=9.729 8x+0.053 5，R2=0.999。

總皂苷質(zhì)量濃度在0～1.4 mg/mL時線性關(guān)系良好?？傇碥蘸?質(zhì)量分數(shù))采用以下公式進行計算：

式中：m為所取樣品質(zhì)量，mg；m1為根據(jù)標準曲線計算出待測液中的皂苷質(zhì)量，mg；n為稀釋倍數(shù)；2.8為無患子中齊墩果烷型皂苷平均分子質(zhì)量與齊墩果酸分子質(zhì)量之比。

1.3.3 總黃酮含量的測定

總黃酮含量采用分光光度計法進行測定[25]。準確稱取200 mg樣品，置于三角瓶中，加入5 mL 75%(體積分數(shù))乙醇，超聲波提取30 min，以4 000 r/min離心20 min，棄去殘渣，取上清液用75%乙醇定容至10 mL，每個樣品重復3次。取1 mL待測液于試管中，加入0.3 mL 5%(質(zhì)量分數(shù))NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min；再加入0.3 mL 10%(質(zhì)量分數(shù))Al(NO3)3溶液，混勻后靜置6 min；再往其中加入4.0 mL 4%(質(zhì)量分數(shù))NaOH溶液、4.4 mL 75%乙醇，使最終體積為10 mL，混勻后靜置12 min，然后測定510 nm處吸光度值。以蘆丁對照品溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：

y=1.141 4x+0.098 9，R2=0.999。

總皂苷質(zhì)量濃度在0～0.6 mg/mL時線性關(guān)系良好。總黃酮含量(質(zhì)量分數(shù))采用以下公式進行計算：

式中：m為所取樣品質(zhì)量，mg；m2為根據(jù)標準曲線計算出待測液中的黃酮質(zhì)量，mg；V為樣品提取液測定用體積，mL；V1為樣品提取液總體積，mL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析、Pearson相關(guān)分析和一元線性回歸分析；實驗數(shù)據(jù)若不服從正態(tài)分布，則進行平方根反正弦轉(zhuǎn)換后再執(zhí)行相應的數(shù)據(jù)分析。采用Origin 2017 SR2軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 無患子不同器官中總皂苷和總黃酮含量的分布

對無患子不同器官中的總皂苷和總黃酮含量進行了測定，結(jié)果見圖1。

LAV. 8個時期葉總皂苷或總黃酮含量的平均值the average content of total saponins or total flavonoids in leaves of eight periods；F1.花苞bud;F2.花朵flower;B.枝branches；R.根root;P.果皮pericarp;SC.種皮testa;SK.種仁kemel. 不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。Different lowercase letters indicate significant differences at the level of 0.05. The same below.

結(jié)果表明，不同器官中總皂苷和總黃酮含量的分布不同，葉(8個時期葉中相應物質(zhì)含量的均值)、花、枝、根、果皮等器官中的總皂苷含量(0.98%～13.26%)均顯著高于總黃酮含量(0.31%～1.74%)，且在種皮和種仁中未檢測到黃酮(圖1)。果皮中的總皂苷含量最高(13.26%)，顯著高于其他器官(P<0.05)；其次為花苞(6.21%)和花朵(5.68%)，花苞與花朵總皂苷含量間差異未達到顯著水平(P>0.05)；葉(4.11%，8個時期平均值)和根(3.88%)中的總皂苷含量相差不大(P>0.05)，但均顯著高于枝(P<0.05)；種皮的總皂苷含量最低(0.98%)。各器官中總黃酮含量主要表現(xiàn)為：葉(1.74%,8個時期平均值)>花苞(0.88%)>花朵(0.74%)>根(0.53%)>枝(0.44%)>果皮(0.31%)，葉中的總黃酮含量分別是花苞、花朵、枝、根、果皮總黃酮含量的1.99、2.35、3.92、3.31和5.65倍，且花苞與花朵間總黃酮含量間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 無患子葉中總皂苷和總黃酮的積累規(guī)律

無患子葉片中總皂苷和總黃酮含量變化趨勢存在一定的差異，各時期葉中的總皂苷含量均比總黃酮含量高(圖2)。隨著生長時間的延長，葉中總皂苷含量總體上呈逐漸升高趨勢，L8時期達到最高(5.35%)，顯著高于其他7個時期(P<0.05)；L1—L5時期，總皂苷含量緩慢升高，L5(4.49%)—L7(4.13%)時期有小幅度下降，但L3—L7時期的總皂苷含量間差異均未達到顯著水平(P>0.05)；而L7—L8時期，總皂苷含量顯著升高(P<0.05)。另一方面，葉中總黃酮含量為1.18%～2.42%，在整個年生長周期內(nèi)呈“升高—降低—升高—降低—升高”趨勢，3次積累高峰分別出現(xiàn)在L2(1.93%)、L6(2.42%)和L8(2.15%)時期，其中L6與L8兩個時期間的總黃酮含量相差不大(P>0.05)。

圖2 無患子葉中總皂苷和總黃酮含量的積累規(guī)律

2.3 無患子不同器官間總皂苷和總黃酮的相關(guān)性特征

對花蕾期的花及果實成熟期的葉、枝、根、果皮、種皮、種仁等器官間的總皂苷或總黃酮含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明不同器官總皂苷和總黃酮含量分布呈現(xiàn)出不同的相關(guān)性特征(表1)。

表1 不同器官間總皂苷和總黃酮含量的Pearson相關(guān)系數(shù)

由表1可見，葉和花的總皂苷含量間呈極顯著負相關(guān)，枝與種皮的總皂苷含量間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；葉和枝間的總黃酮含量呈顯著負相關(guān)，果皮和根間的總黃酮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。

2.4 無患子中總皂苷和總黃酮間的相關(guān)性特征

以總黃酮含量為因變量，總皂苷含量為自變量，采用一元線性回歸分析無患子中總皂苷和總黃酮含量間的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示，總皂苷(x)和總黃酮(y)間的線性關(guān)系為:

圖3 總皂苷含量與總黃酮含量之間的相關(guān)性

y=-0.093x+1.755(R2=0.107，P=0.024)。

可見，無患子總皂苷含量與總黃酮含量間呈現(xiàn)出一定的負相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

皂苷和黃酮類化合物是植物中典型的次級代謝物，廣泛存在于高等植物中。皂苷參與植物的通訊、防御和感覺調(diào)控[26]；黃酮具有保護植物免受各類生物或非生物脅迫傷害的作用[25]。然而，這些化合物在不同植物器官中的具體形態(tài)和分布存在很大差異[10]。本研究表明，無患子不同器官中總皂苷和總黃酮含量分布情況不同，皂苷分布于葉、花、枝、根、果皮、種皮、種仁等器官中，而黃酮僅在葉、花、枝、根、果皮中被檢測到，同時各器官中總皂苷含量均顯著高于總黃酮，說明皂苷是無患子各器官的主要次生代謝物。另外，果皮中的總皂苷含量最高，其次為花和葉；總黃酮含量由大到小順序為：葉、花、根、枝、果皮，這表明無患子中除了果皮富含皂苷，花和葉中也積累了較高水平的皂苷和黃酮。皂苷和黃酮在無患子各器官中的不均衡分布可能與其執(zhí)行不同的功能有關(guān)，葉和根等營養(yǎng)器官及花和果等生殖器官中較高含量的皂苷，可以有效抵御病蟲害，以保證正常的生長和繁殖[27-28]；同時，葉片中較高含量的總黃酮，可以保護植物免受昆蟲和病原體侵害[29]，還能有效減少UV-B輻射對葉片造成的傷害[30-31]。

無患子葉中的總皂苷和總黃酮含量在整個生長季變化較為明顯，且呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。隨著生長時間的延長，總皂苷含量總體上呈逐漸升高趨勢，在L8時期達到最高；而總黃酮含量波動變化，3次積累高峰分別出現(xiàn)在L2、L6和L8時期?；ɡ倨?L2)葉片光合作用能力強，為次級代謝提供了更多的原料和底物，可能產(chǎn)生并積累了較多的黃酮類化合物[32]；盛花期(L3)后無患子進入初果期，葉中總皂苷含量增加緩慢，總黃酮含量保持在較低水平，這可能與生殖生長期間大量營養(yǎng)物質(zhì)向果實部位運轉(zhuǎn)有關(guān)；在果實膨大期(L6)葉中總皂苷水平小幅度降低，而黃酮含量達到最大值，這可能是由于此時光合產(chǎn)物被用于合成黃酮，皂苷合成可能受到抑制或被轉(zhuǎn)移到其他器官；在果實成熟期(L8)植物停止生長，光合產(chǎn)物被重新分配到次級代謝物合成上[32]，使葉中總皂苷和總黃酮含量又顯著升高。無患子葉中總皂苷和總黃酮含量呈現(xiàn)出一定的季節(jié)性變化規(guī)律，是其自身基因表達調(diào)控和環(huán)境影響的共同結(jié)果[33]，前人在落葉松(Larixgmelinii)[32]、北柴胡[8]、黃蜀葵(Abelmoschusmanihot)[3]、牛膝[5]、三七[34]等植物的研究中也有類似結(jié)論。

無患子葉中總黃酮含量為1.18%～2.42%，與幾種葉中總黃酮含量較高的樹種相比，無患子葉中的總黃酮含量較銀杏(2.50%～3.80%)[35]和青錢柳(4.47%～6.78%)[4]小，但與喜樹葉中的總黃酮含量(0.24%～2.61%)相差不大[36]，說明無患子葉中的黃酮也具有一定的利用價值。本研究結(jié)果表明，葉(果實成熟期)和花(花蕾期)的總皂苷含量間極顯著負相關(guān)，枝與種皮的總皂苷含量間呈極顯著正相關(guān)，葉(果實成熟期)和枝間的總黃酮含量呈顯著負相關(guān)，果皮和根間的總黃酮含量呈極顯著正相關(guān)，可以推測無患子不同器官間的皂苷或黃酮含量具有一定的聯(lián)系。然而，皂苷和黃酮在無患子中的合成、儲存和轉(zhuǎn)移途徑，仍有待進一步研究。此外，無患子中總皂苷含量與總黃酮含量間呈現(xiàn)一定的負相關(guān)關(guān)系，說明無患子中皂苷和黃酮的積累可能存在著間接競爭關(guān)系，這可能是植物中皂苷和黃酮的生物合成在原料或前體物質(zhì)上存在著某些競爭導致的，例如，糖酵解產(chǎn)物丙酮酸氧化生成的乙酰輔酶A是三萜皂苷生物合成的原料，而糖酵解中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸是黃酮生物合成的原料[37-38]。而皂苷和黃酮等次生代謝物間的代謝關(guān)系相當復雜，相關(guān)機制還需進一步探討。

無患子屬落葉大喬木，枝葉茂盛，通常人們只采收其果實，進行加工利用。本研究結(jié)果表明無患子葉和花也含有較高含量的皂苷和黃酮，如能將其合理開發(fā)利用，可提高無患子的綜合利用價值。植物的生長發(fā)育和活性成分的積累模式是幫助確定最適宜采收期的兩個重要指標[39]。無患子葉片中總皂苷和總黃酮在果實成熟期(L8)均積累到較高水平，且在果實成熟后，無患子逐漸進入落葉期[40]，在采收果實的時候，可以一并采收葉子，用于提取皂苷或黃酮，但如何實現(xiàn)其開發(fā)利用需要深入研究。蔡佳杰等[41]研發(fā)出一種無患子茶的加工方法，該茶以無患子樹葉為原料進行制作，具有一定的保健作用。無患子萌芽能力強，在采集枝條或葉子后，能迅速萌生出新枝和葉，同時無患子葉多且易于采集，或可以考慮建立無患子葉用原料林，供采集嫩葉用于制茶或采集成熟葉作為提取皂苷或黃酮的原料。此外，無患子的花序?qū)儆诖笮蛨A錐花序，雌雄同株，花量大[40, 42]，開花結(jié)果過多，常會造成樹體養(yǎng)分供應不足，影響果實的正常發(fā)育，在生產(chǎn)上常采取疏花等措施來減少樹體養(yǎng)分消耗。由于無患子花苞中含有較高的總皂苷和總黃酮，且花苞和花朵的總皂苷和總黃酮含量相差不大，考慮到無患子花的綜合利用，建議在花蕾期進行疏花，并將采集下來的花苞進一步開發(fā)成茶或其他保健品，以用代撫，可以實現(xiàn)無患子多功能綜合利用。

綜上，無患子總皂苷和總黃酮在不同器官中的分布及其在葉中的積累規(guī)律不同，皂苷主要存在于果皮、花和葉，總黃酮主要分布在葉和花中；不同器官間的總皂苷或總黃酮含量具有一定相關(guān)性，皂苷和黃酮的積累之間可能存在著間接競爭關(guān)系；除傳統(tǒng)的利用部位果皮，還可以合理地采收無患子的葉和花，對其進行開發(fā)利用。然而，如何有效利用無患子葉和花等器官，了解皂苷和黃酮在不同器官中的分布機制及其生物合成機制等將成為未來需要解決的科學問題。

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