鱸魚(yú)脯氨酰內(nèi)肽酶的分離純化、性質(zhì)分析及分子克隆

楊汝晴，陳守峰，肖琳琳，陳玉磊,2，孫樂(lè)常,2，張凌晶,2，劉光明,2，曹敏杰,2,

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.海洋食品深加工協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

脯氨酰內(nèi)肽酶（prolyl endopeptidase，PEP）又稱(chēng)脯氨酸寡肽酶，是絲氨酸蛋白酶家族中的一員[1]。該酶不同于經(jīng)典的胰蛋白酶-枯草桿菌絲氨酸蛋白酶，PEP家族的分子質(zhì)量（約80 kDa）普遍大于胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶（25～30 kDa）?；谄鋵?duì)肽底物的特異性和不同的活性中心結(jié)構(gòu)，PEP代表了一類(lèi)相對(duì)較新的絲氨酸蛋白酶[2]。PEP易在含有脯氨酸殘基的羧基處切割肽鍵，它也會(huì)在丙氨酸殘基處分解，但水解速度較慢。PEP最顯著的特性是對(duì)分解底物的選擇性，僅限于長(zhǎng)度不超過(guò)30 個(gè)氨基酸殘基的寡肽[3]。

PEP最初是在人子宮中被發(fā)現(xiàn)，用于水解催產(chǎn)素半胱氨酰-酪氨酰-異亮氨酰-谷氨酰胺酰-天冬酰胺酰-半胱氨酰-脯氨酰-亮氨酰-甘氨酸（Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2）脯氨酸殘基的C末端釋放亮氨酰甘氨酸[4]。進(jìn)一步工作發(fā)現(xiàn)PEP在水解生物活性肽如促甲狀腺素釋放激素、物質(zhì)P、精氨酸加壓素、神經(jīng)緊張素、血管緊張素等方面也有作用[5]。此外，PEP是阿爾茨海默癥、健忘癥、抑郁癥等疾病治療的靶標(biāo)酶[6]，針對(duì)PEP的特異性抑制劑有望成為候選藥物[7-8]。在啤酒釀造過(guò)程中添加PEP，可水解來(lái)源于富含脯氨酸殘基的α-醇溶蛋白多肽，達(dá)到防止啤酒渾濁、穩(wěn)定其質(zhì)量的效果[9-10]。該酶還用于重組功能肽的制備和口服治療由于攝入麩質(zhì)引起的過(guò)敏反應(yīng)[11-12]。由于PEP獨(dú)特的底物特異性，其可能與基質(zhì)金屬蛋白酶等一起參與富含脯氨酸殘基的動(dòng)物肌肉膠原的新陳代謝以及死后的軟化自溶[13-14]。

在水產(chǎn)動(dòng)物PEP研究方面，鯉魚(yú)、羅非魚(yú)等淡水魚(yú)類(lèi)骨骼肌中的PEP已被純化和表征[13,15]，海水魚(yú)藍(lán)圓鰺PEP也得到了初步研究[16]。鱸魚(yú)（Lateolabrax japonicus）由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的風(fēng)味已成為我國(guó)沿海地區(qū)一種重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。但海水魚(yú)類(lèi)PEP的詳細(xì)性質(zhì)、基因序列、結(jié)構(gòu)特征等還鮮有報(bào)道。因此，本研究擬以海水鱸魚(yú)為研究對(duì)象，從其肌肉中純化PEP并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，克隆PEP全長(zhǎng)序列并通過(guò)同源建模解析鱸魚(yú)PEP的結(jié)構(gòu)，旨在為深入研究海水魚(yú)類(lèi)PEP的酶學(xué)性質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鱸魚(yú)平均體質(zhì)量約1 kg，購(gòu)于廈門(mén)市集美菜市場(chǎng)。

DEAE-Sepharose、Phenyl-Sepharose HiTrap、DEAESepharose Fast Flow 美國(guó)GE Healthcare公司；琥珀酰-甘氨酰-脯氨酸-4-甲基-7-香豆素（succinyl-glycyl-L-proline-4-methylcoumaryl-7-amide，Suc-Gly-Pro-MCA）等熒光底物 日本Peptide Institute公司；PEP特異性抑制劑SUAM-14746、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF） 美國(guó)Sigma公司；半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64 美國(guó)Amresco公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 青島福林生物化學(xué)公司；牛血清蛋白、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺 美國(guó)Bio-Rad公司；Oligo dT、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker、2×SYBR?Premix ExTaqTMII 日本TaKaRa公司；pMD?18-T載體、T1感受態(tài)細(xì)胞 北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PT-2100組織搗碎機(jī) 瑞士Kinematica公司；Avanti J-26SXP高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；Lamda 35紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司；FP-8200熒光分光光度計(jì) 日本Jasco公司；G:BOX凝膠成像儀英國(guó)Synegene公司；Chirascan圓二色譜儀 英國(guó)Applied Photophysics公司；C1000-Touch聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 鱸魚(yú)PEP的純化

所有純化步驟均在4 ℃進(jìn)行。鱸魚(yú)即殺后取肌肉800 g，切碎，將其在4 倍體積的緩沖液A（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，含4 mmol/L 2-巰基乙醇）中組織搗碎，15 000×g離心30 min，所得上清液即為PEP粗酶。

粗酶經(jīng)60%～80%飽和度的(NH4)2SO4溶液鹽析，所得沉淀溶解于少量的緩沖液A中，并用緩沖液A充分透析。透析樣品上樣于DEAE-Sepharose陰離子交換柱（2.5 cm×15 cm），經(jīng)緩沖液A充分流洗后，以0～0.3 mol/L的NaCl溶液線性梯度洗脫。收集酶活力較高部分，加入(NH4)2SO4至終濃度為1.2 mol/L，上樣于Phenyl-Sepharose，以1.2～0 mol/L (NH4)2SO4溶液線性梯度洗脫，收集活性部分，用緩沖液A透析后上樣于HiTrap DEAE-Sepharose Fast Flow（5 mL）并以0～0.3 mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫。將活性部分收集即為純化的PEP，立即用于酶學(xué)性質(zhì)分析。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對(duì)酶的純度進(jìn)行分析。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.2 PEP活力測(cè)定

參考謝雪瓊等[17]的方法并作少量修改。將50 μL酶溶液溶于900 μL的25 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 6.0）中，加入50 μL、10 μmol/L的底物Suc-Gly-Pro-MCA，在35 ℃孵育30 min后，加入1.5 mL終止液（甲醇-異丙醇-蒸餾水（35∶30∶35，V/V））終止反應(yīng)。用熒光分光光度計(jì)在380 nm激發(fā)波長(zhǎng)和450 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定產(chǎn)物7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）的熒光強(qiáng)度。酶活力單位定義為每分鐘釋放1 nmol AMC的量。

1.3.3 肽序列的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

采用考馬斯藍(lán)染料對(duì)SDS-PAGE進(jìn)行染色，脫色后切膠獲取目的蛋白條帶，送往深圳市微納菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。

1.3.4 溫度和pH值對(duì)PEP活力的影響

通過(guò)在不同溫度（15、25、35、45、55、65 ℃）條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)確定PEP的最適溫度。研究PEP的熱穩(wěn)定性，將PEP置于不同溫度條件下孵育30 min，然后立即在冰水中冷卻，在35 ℃條件下測(cè)定殘余活力。

確定PEP的最適pH值，在35 ℃條件下用不同pH值（pH 3.0～9.0）的緩沖液進(jìn)行酶活力測(cè)定。對(duì)PEP進(jìn)行pH值穩(wěn)定性研究，將PEP置于各pH值緩沖液中，4 ℃孵育6 h，取50 μL酶溶液和900 μL 25 mmol/L PBS（pH 6.0）混合，35 ℃反應(yīng)30 min。測(cè)定其剩余酶活力。

1.3.5 抑制劑對(duì)PEP活力的影響

分析蛋白酶抑制劑對(duì)PEP活力的影響，將PEP與蛋白酶抑制劑在室溫下孵育30 min，然后按1.3.2節(jié)方法測(cè)定剩余酶活力。以不添加抑制劑的反應(yīng)體系為對(duì)照。

1.3.6 圓二色譜分析

采用圓二色譜法分析熱變性和冷卻復(fù)性過(guò)程中PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。操作參數(shù)如下：樣品（0.2 mg/mL）從25 ℃加熱到95 ℃，然后從95 ℃冷卻到25 ℃，速率為2 ℃/min，波長(zhǎng)為190～260 nm。為了研究鱸魚(yú)PEP的變性溫度Tm值，數(shù)據(jù)通過(guò)Prism（version 7.0）進(jìn)行擬合分析。

1.3.7 PEP分子克隆及多序列比對(duì)

根據(jù)GenBank中已經(jīng)報(bào)道的多個(gè)物種PEP的基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。首先進(jìn)行鱸魚(yú)PEP開(kāi)放閱讀框部分基因克隆。在獲得片段序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3’RACE/5’RACE的特異性引物（表1）。

表1 PEP基因克隆相關(guān)引物Table 1 Primers used for the cloning of PEP

采用Eastep?總RNA提取試劑盒從鱸魚(yú)肌肉組織中提取總RNA，用PrimeScript II Strand cDNA合成試劑盒合成第1鏈cDNA。通過(guò)快速擴(kuò)增cDNA末端（RACE）獲得3’/5’RACE-ready cDNA。以3’/5’RACE-ready cDNA為模板，通過(guò)嵌套式PCR擴(kuò)增并將所有PCR產(chǎn)物均經(jīng)凝膠純化，連接到pMD?18-T載體上，轉(zhuǎn)化到T1感受態(tài)細(xì)胞中。對(duì)陽(yáng)性克隆的片段進(jìn)行測(cè)序，并組裝成PEP的全長(zhǎng)cDNA（NCBI：KX688546.1）。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLAST搜尋來(lái)源于人以及紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）的PEP序列；利用MEGA 5軟件、Espript 3.0和Clustal網(wǎng)站對(duì)3 種酶的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次進(jìn)行測(cè)定。應(yīng)用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。凝膠成像圖片采用Adobe Illustrator CS5進(jìn)行標(biāo)注。采用Prism（version 7.0）軟件擬合PEP的變性溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEP的分離純化及質(zhì)譜鑒定

如圖1所示，(NH4)2SO4鹽析后的PEP粗酶液通過(guò)DEAE-Sepharose陰離子交換柱，大部分的雜蛋白在流洗部分被去除，當(dāng)NaCl濃度為0.25 mol/L時(shí)，PEP被洗脫下來(lái)，再上樣于Phenyl-Sepharose HiTrap疏水層析柱，在未吸附部分去除大部分雜蛋白。收集活性部位，經(jīng)HiTrap DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析后酶活峰與蛋白峰重疊。通過(guò)SDS-PAGE分析（圖1D），該酶顯示出對(duì)應(yīng)于80 kDa的單一條帶，說(shuō)明PEP得到高度純化。該蛋白的分子質(zhì)量與已報(bào)道來(lái)源于鯉魚(yú)、羅非魚(yú)骨骼肌的PEP分子質(zhì)量相似[13,15]。從800 g鱸魚(yú)骨骼肌中純化得到0.7 mg的PEP，得率為0.3%，純化倍數(shù)為238.1 倍（表2）。

圖1 PEP的柱層析純化及SDS-PAGEFig.1 Column chromatography purification of PEP and SDS-PAGE pattern of purified PEP

表2 鱸魚(yú)PEP的純化結(jié)果Table 2 Summary of purification procedure of prolyl endopeptidase from sea bass

將純化的PEP電泳后切膠，經(jīng)胰蛋白酶酶解后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，共得到43 個(gè)肽段。通過(guò)NCBI上的BLAST分析，結(jié)果如圖2所示，所得到的43 個(gè)肽片段與紅鰭東方鲀的PEP（XP_003971930.1）序列高度一致，表明純化的蛋白為PEP。

圖2 純化PEP的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析Fig.2 LC-MS/MS analysis of purified PEP

2.2 PEP的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1 底物特異性

選用不同類(lèi)型的熒光底物對(duì)PEP的底物特異性進(jìn)行研究，結(jié)果如表3所示。鱸魚(yú)PEP對(duì)PEP底物Suc-Gly-Pro-MCA和琥珀酰-甘氨酰-脯氨酰-亮氨酰-甘氨酰-脯氨酸-4-甲基香豆素-7-酰胺（succinyl-glycyl-L-prolyl-L-leucylglycyl-L-proline-4-methylcoumaryl-7-amide，Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MCA）水解能力強(qiáng)，而對(duì)胰蛋白酶底物叔丁基氧羰基-谷氨酰胺酰-精氨酰-精氨酸-4-甲基-7-香豆素（t-butyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-arginyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide，Boc-Gln-Arg-Arg-MCA）、叔丁基氧羰基-苯丙氨酰-絲氨酰-精氨酸-4-甲基-7-香豆素（t-butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-seryl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide，Boc-Phe-Ser-Arg-MCA），胰凝乳蛋白酶底物琥珀酰-亮氨酰-亮氨酰-纈氨酰-酪氨酸-4-甲基-7-香豆素（succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-valyl-L-tyrosine-4-methylcoumaryl-7-amide，Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA），組織蛋白酶底物芐氧羰基-苯丙氨酰-精氨-4-甲基-7-香豆素（benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-arginine 4-methylcoumaryl-7-amid，Z-Phe-Arg-MCA）、芐氧羰基-精氨酰-精氨酸-4-甲基-7-香豆素（benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-arginine-4-methylcoumaryl-7-amide，Z-Arg-Arg-MCA），氨肽酶底物脯氨酸-4-甲基-7-香豆素（L-prolin-4-methylcoumaryl-7-amide，Pro-MCA）和甲硫氨酸-4-甲基-7-香豆素（L-methionine-4-methylcoumaryl-7-amide，Met-MCA）均不分解。PEP不能水解含脯氨酸的氨肽酶底物Pro-MCA，證實(shí)了PEP是一種內(nèi)肽酶[18]。

表3 PEP的底物特異性Table 3 Substrate specificity of PEP

2.2.2 抑制劑對(duì)PEP的影響

如表4所示，PEP的特異性抑制劑SUAM-14746能夠完全抑制PEP活力，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對(duì)PEP也具有強(qiáng)烈的抑制作用。金屬蛋白酶抑制劑EDTA、半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64則幾乎沒(méi)有抑制作用。這些結(jié)果反映了PEP是一類(lèi)特殊的絲氨酸蛋白酶。

表4 抑制劑對(duì)PEP活力的影響Table 4 Effects of inhibitors on PEP activity

2.2.3 最適溫度和熱穩(wěn)定性分析

在pH 6.0的25 mmol/L PBS中，以Suc-Gly-Pro-MCA為底物，測(cè)定不同溫度下酶的相對(duì)活力。如圖3A所示，鱸魚(yú)PEP的最適溫度為35 ℃，在15～35 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的逐漸升高，鱸魚(yú)PEP活力也逐漸增加；當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，活力迅速降低。在15～35 ℃范圍內(nèi)PEP活力較穩(wěn)定，當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)PEP活力開(kāi)始降低，45 ℃以上時(shí)PEP活力急劇下降，45 ℃活性?xún)H保持20%，65 ℃時(shí)，活性不足10%，說(shuō)明該酶的熱穩(wěn)定性較差。

圖3 溫度（A）和pH值（B）對(duì)PEP活力的影響Fig.3 Effect of temperature and pH on the activity of PEP

2.2.4 最適pH值和pH值穩(wěn)定性

如圖3B所示，在pH 4.0～6.0范圍時(shí)，隨著pH值的逐漸升高，鱸魚(yú)PEP的活性逐漸增加；在pH 6.0～9.0范圍時(shí)，隨著pH值的逐漸升高，酶活力逐漸減少直至完全失活。因此，鱸魚(yú)PEP的最適pH值為6.0。鱸魚(yú)PEP在pH 5.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，活力可保持在80%以上。而當(dāng)pH值低于5或者高于8.0時(shí)，酶活力快速下降，與已經(jīng)報(bào)道的羅非魚(yú)肌肉中純化的PEP結(jié)果相似[15]。

2.3 溫度對(duì)PEP結(jié)構(gòu)的影響

為了研究溫度對(duì)PEP結(jié)構(gòu)變化的影響，用圓二色譜分析PEP的熱變性曲線。天然PEP在25 ℃呈典型的β-折疊結(jié)構(gòu)（圖4A），在215 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)負(fù)最大峰，在圓二色譜192 nm波長(zhǎng)處為正的最小峰。PEP主要是由α-螺旋的催化結(jié)構(gòu)域，以及β-折疊形成β-螺旋槳的非催化區(qū)域組成[19]。當(dāng)PEP被加熱到95 ℃時(shí)，192 nm波長(zhǎng)處的峰值降低，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。當(dāng)溫度從95 ℃又下降到25 ℃時(shí)，PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)不能恢復(fù)，說(shuō)明PEP的熱變性是不可逆的。在200 nm波長(zhǎng)處用圓二色譜監(jiān)測(cè)PEP的構(gòu)象變化（圖4B），結(jié)果表明，PEP的結(jié)構(gòu)在20～40 ℃范圍內(nèi)變化最小，表明在該溫度范圍內(nèi)PEP結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。溫度高于40 ℃時(shí)，PEP結(jié)構(gòu)變化較為明顯，而高于60 ℃后，PEP結(jié)構(gòu)保持不變，說(shuō)明PEP變性已完成。通過(guò)Prism（version 7.0）擬合分析，發(fā)現(xiàn)鱸魚(yú)PEP的變性溫度Tm為（51.2±0.3）℃。

圖4 圓二色譜檢測(cè)溫度對(duì)PEP結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of temperature on the structure of PEP detected by CD spectroscopy

2.4 PEP的分子克隆

為了更多了解PEP的結(jié)構(gòu)特性，通過(guò)比對(duì)已報(bào)道的不同物種PEP的序列設(shè)計(jì)引物，得到鱸魚(yú)PEP的編碼區(qū)中間部分基因。根據(jù)得到的基因片段分別設(shè)計(jì)3’末端和5’末端引物（圖5A），再經(jīng)過(guò)一系列PCR擴(kuò)增，對(duì)所得到的基因進(jìn)行拼接，最終獲得鱸魚(yú)PEP cDNA的全長(zhǎng)為3 029 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)度為2 223 bp，編碼741 個(gè)氨基酸殘基的開(kāi)放閱讀框。5’端非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR）長(zhǎng)度為30 bp，3’端UTR長(zhǎng)度為776 bp，通過(guò)ProtParam網(wǎng)站（https://web.expasy.org/protparam/）計(jì)算其理論分子質(zhì)量為84.12 kDa，在GenBank登錄號(hào)為KX688546.1。運(yùn)用Swiss-Model以人源脯氨酰內(nèi)肽酶PEP（PDB∶3DDU）為模板，進(jìn)行同源建模分析其結(jié)構(gòu)。如圖5B所示，鱸魚(yú)PEP包含α/β水解肽酶結(jié)構(gòu)，其催化三聯(lián)體（His-711、Asp-672、Ser-585）被β-折疊形成的螺旋槳區(qū)域的中心通道所覆蓋。該β-折疊螺旋槳結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)門(mén)控過(guò)濾器的作用，將分子質(zhì)量大、結(jié)構(gòu)化的肽從活性位點(diǎn)排除[2]。

圖5 PEP的分子克隆及同源建模Fig.5 Molecular cloning and homology modeling of PEP

利用MEGA 5軟件、Espript 3.0和Clustal網(wǎng)站對(duì)鱸魚(yú)PEP、紅鰭東方鲀PEP（GenBank：XP_003971930.1）、人源（Homo sapiens）PEP（GenBank：BAB19053.1）以及皺紋盤(pán)鮑（Haliotis discus hannai）PEP（GenBank：ARR29117.1）的蛋白序列進(jìn)行同源性比對(duì)。多序列比對(duì)結(jié)果表明，鱸魚(yú)PEP氨基酸序列與紅鰭東方鲀PEP的同源性高達(dá)92.1%，與人及皺紋盤(pán)鮑PEP的同源性為72.1%和58.3%（圖6），但與黃桿菌來(lái)源的PEP的序列相似性?xún)H有38.3%。以上結(jié)果表明，相似物種中PEP高度保守，但不同物種間的序列差異性較大。

圖6 PEP與其他物種的多序列比對(duì)Fig.6 Multiple sequence alignment of PEP with that from other species

3 討 論

為了研究海水魚(yú)肌肉中PEP的性質(zhì)，解明其結(jié)構(gòu)特性，本研究從鱸魚(yú)肌肉中高度純化PEP。不同物種PEP的分子質(zhì)量大小存在較大差異，60～87 kDa不等[20-24]。從鱸魚(yú)肌肉中純化的PEP分子質(zhì)量約為80 kDa，與鯉魚(yú)肌肉（82 kDa）[13]和人腦（80 kDa）[25]中PEP的分子質(zhì)量相似。對(duì)底物特異性研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的蛋白酶都無(wú)法在脯氨酸殘基上水解，而PEP幾乎能分解所有長(zhǎng)度小于30 個(gè)氨基酸殘基并內(nèi)含脯氨酸殘基的肽[26]。

構(gòu)象對(duì)蛋白酶的活性有重要影響，而構(gòu)象的改變大多與溫度有關(guān)[27]。PEP的最適溫度為35 ℃，但是其熱穩(wěn)定性較差，在較低的溫度范圍（4～37 ℃）內(nèi)能保持較高的活性[22,28]，當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，酶活力急劇下降。采用圓二色譜法測(cè)定了熱變性前后PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，加熱對(duì)PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯改變，且該熱變性過(guò)程不可逆。PEP熱穩(wěn)定較差可能與其活性部位的構(gòu)象易受溫度影響相關(guān)。當(dāng)加熱溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)即開(kāi)始發(fā)生變化（圖4B），酶活力也明顯下降。作為絲氨酸蛋白酶，PEP的活性中心由His、Asp和Ser組成催化三聯(lián)體構(gòu)象。溫度升高后三聯(lián)體的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變導(dǎo)致酶失活[27]。PEP活力形式和非活性形式的主要區(qū)別在于酶活力中心，一般地，活性中心比蛋白整體對(duì)熱更敏感，活性損失總是先于蛋白變性[29]。因此，當(dāng)溫度升高酶失去活性時(shí)，并不表示蛋白整體構(gòu)象已發(fā)生改變。

迄今為止，PEP基因已從許多生物體中被克隆得到[30-31]。然而，對(duì)魚(yú)類(lèi)PEP基因序列和結(jié)構(gòu)的研究卻很少。作為魚(yú)類(lèi)PEP基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的初步研究，克隆了編碼741 個(gè)氨基酸殘基的鱸魚(yú)PEP基因，該基因比來(lái)源于哺乳動(dòng)物和微生物的PEP基因稍長(zhǎng)[28,32]。根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列和已知的人源模板蛋白的結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)了鱸魚(yú)PEP的三維結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)與已經(jīng)報(bào)道的人、豬以及微生物PEP的結(jié)構(gòu)基本相似[19,28,33]，都以典型的α/β水解酶折疊排列，包括催化結(jié)構(gòu)域和β-螺旋槳兩個(gè)結(jié)構(gòu)組成，β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域呈放射狀布置在埋入圓柱內(nèi)的中央通道周?chē)鶾18]。相比于動(dòng)物源PEP，微生物PEP能降解長(zhǎng)度更長(zhǎng)的底物，這是由于微生物PEP的催化結(jié)構(gòu)域和β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域中存在一個(gè)構(gòu)象柔軟的開(kāi)放形態(tài)[34]，而動(dòng)物源PEP的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間是閉環(huán)狀態(tài)[35]。PEP基于這樣的獨(dú)特結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)對(duì)進(jìn)入催化結(jié)構(gòu)域的底物長(zhǎng)度進(jìn)行有效控制[19]。作為能夠特異性切割脯氨酸殘基的內(nèi)源性蛋白酶，在前期的工作中PEP已被證實(shí)參與膠原小肽的降解，因此推測(cè)其與魚(yú)類(lèi)死后自溶過(guò)程中肌肉彈性下降關(guān)系密切的膠原蛋白降解相關(guān)[13-14]。但是，PEP在魚(yú)體內(nèi)，特別是生理?xiàng)l件下肌肉內(nèi)的主要功能并不清晰。為了進(jìn)一步解明魚(yú)類(lèi)PEP在肌肉內(nèi)的功能與作用，下階段有必要從組織分布以及結(jié)構(gòu)信息學(xué)角度深入分析。

4 結(jié) 論

從鱸魚(yú)骨骼肌中純化得到PEP，確定其分子質(zhì)量約為80 kDa，最適pH值為6.0，最適溫度為35 ℃。溫度變化對(duì)酶活力和二級(jí)結(jié)構(gòu)影響較大，且酶活力變化的溫度低于蛋白整體的變性溫度。通過(guò)分子克隆技術(shù)獲得PEP全長(zhǎng)序列含2 226 個(gè)核苷酸，編碼741 個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)同源建模得到鱸魚(yú)PEP的分子結(jié)構(gòu)，其中His-711、Asp-672、Ser-585構(gòu)成空間構(gòu)象的活性中心。PEP活性部分更容易受到溫度影響而使三聯(lián)體的結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致酶失活，而PEP的底物特異性也與其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)。由于PEP水解脯氨酸殘基的底物特異性，PEP很可能與魚(yú)體肌肉中富含脯氨酸殘基的膠原蛋白的新陳代謝密切相關(guān)。