基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接探討中藥枸骨葉抗腫瘤的作用機(jī)制

龍書可　方玲子　林菲娟　鄧燕桃　姜倩倩

〔摘要〕 目的 從網(wǎng)絡(luò)視角出發(fā)，探討枸骨葉抗腫瘤的的可能作用機(jī)制，為其臨床使用提供依據(jù)。方法 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）、中醫(yī)百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（ETCM）及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，獲取枸骨葉的有效成分及潛在靶點(diǎn)。利用人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）結(jié)果對(duì)比，獲得枸骨葉與腫瘤重合的潛在靶點(diǎn)基因，并通過(guò)Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建枸骨葉的“候選成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建藥物抗腫瘤的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò);并通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證和篩選潛在的核心化合物，利用DAVID生物信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結(jié)果 共篩選出枸骨葉抗腫瘤的作用的靶點(diǎn)137個(gè)，對(duì)應(yīng)13種有效成分。關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及TP53、MAPK1、STAT3等。主要通過(guò)調(diào)控腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/AKT）信號(hào)通路、腫瘤抑制因子P53信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等發(fā)揮抗癌作用。涉及的癌種包括前列腺癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等。分子對(duì)接結(jié)果顯示，長(zhǎng)梗冬青苷與MAPK1能穩(wěn)定地結(jié)合并通過(guò)蛋白氨基酸Gly32、Glu33、Gly34、Tyr36等發(fā)生相互作用。結(jié)論 枸骨葉抗腫瘤作用的主要機(jī)制涉及槲皮素、熊果酸、長(zhǎng)梗冬青苷、芒柄花黃素為代表的多成分，以TP53、MAPK1及STAT3為代表的多靶點(diǎn)，以及細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)為代表的多通路。

〔關(guān)鍵詞〕 枸骨葉;抗腫瘤;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接

〔中圖分類號(hào)〕R273? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.03.021

〔Abstract〕 Objective To explore the anti-cancer potential of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） from a network perspective， so as to provide a theoretical basis for its clinical use. Methods The effective components and potential targets of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） were obtained through the traditional Chinese medicine （TCM） systems pharmacology database （TCMSP）， the encyclopedia of TCM （ETCM） and refer to relevant literatures. By comparing the results of human genome database （GeneCards）， the overlapping genes of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） and cancer were collected. The "candidate active components-targets" network of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） was built with Cytoscape 3.6.0 software. The anti-tumor protein interaction （PPI） network was constructed using the STRING database and Cytoscape 3.6.0 software. Through molecular docking verification and screening of potential core compounds. The gene ontology （GO） classification enrichment analysis and the kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis for the targets were carried out in DAVID database. Results Total 137 anti-tumor targets of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） were screened out， corresponding to 13 active components. Key targets involved TP53， MAPK1， STAT3， etc. It mainly plays an anti-cancer role by regulating tumor necrosis factor （TNF） signaling pathway， hypoxia induced-factor-1 （HIF-1） signaling pathway， phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K/AKT） signaling pathway， tumor suppressor factor P53 signaling pathway， T cell receptor signaling pathway， etc. The cancers involved prostate cancer， pancreatic cancer， non-small cell lung cancer， etc. Molecular docking results showed that pedunculoside and MAPK1 could bind stably and interact with each other through protein amino acids such as Gly32， Glu33， Gly34 and Tyr36. Conclusion The main mechanism of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） in treating cancer is involved to multiple compounds represented by quercetin， ursolic acid， pedunculoside and formononetin， and multiple targets represented by TP53， MAPK1 and STAT3， and multiple signaling pathways represented by cell proliferation， apoptosis and signal transduction.

〔Keywords〕 Gouguye （Ilicis Cornutae Folium）; anti-cancer; network pharmacology; molecular docking

近年來(lái)，腫瘤患者的新發(fā)病例越來(lái)越多，嚴(yán)重威脅人類的身體健康，我國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全國(guó)癌癥新發(fā)病例數(shù)為380.4萬(wàn)例，死亡病例229.6萬(wàn)例[1]。隨著化療、靶向治療及免疫治療的應(yīng)用，越來(lái)越多腫瘤患者從中獲益，而中醫(yī)藥治療作為我國(guó)腫瘤治療的重要組成部分，采取辨病與辨證相結(jié)合的辦法，可以配合腫瘤放化療等治療手段，有效減輕毒副作用，抑制瘤體的增大，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，利于改善患者對(duì)腫瘤治療的耐受能力[2]。

枸骨葉為冬青科植物枸骨Ilex cornuta Lindl.ex Paxt.的干燥葉，具有清熱養(yǎng)陰、平肝益腎作用，用于肺癆咯血、骨蒸潮熱、頭暈?zāi)垦５劝Y狀[3]?，F(xiàn)代研究[4-8]表明，枸骨葉具有降脂、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用，其中主要化學(xué)成分長(zhǎng)梗冬青苷、熊果酸、槲皮素等對(duì)多種惡性腫瘤均有較好的治療作用。臨床運(yùn)用中，含枸骨葉的方劑“扶肺煎”治療肺癌的藥理作用已有相關(guān)報(bào)道[9]，但枸骨葉基礎(chǔ)研究較少，其抗腫瘤的藥用有效成分、靶點(diǎn)、通路和相關(guān)分子作用機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)及生物信息學(xué)的新興學(xué)科，能整體系統(tǒng)地分析“藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”之間的相互關(guān)系，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究提供了新的研究思路。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索枸骨葉的主要化學(xué)成分、核心靶點(diǎn)以及與腫瘤之間的相互關(guān)系，為進(jìn)一步闡明枸骨葉抗腫瘤的作用機(jī)制提供思路和理論基礎(chǔ)[10-11]。

1 材料與方法

1.1? 數(shù)據(jù)庫(kù)、分析平臺(tái)及軟件來(lái)源

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP， https：//tcmspw.com/tcmsp.php）;中醫(yī)百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（ETCM，

http：//www.tcmip.cn/ETCM/）;有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)（PubChem， https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）;Swiss TargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）;人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards， https：//www.

genecards.org/）;DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/）;DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）;RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）;STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）;Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//metascape.org/gp/）;在線云平臺(tái)OmicShare網(wǎng)站（https：//www.omicshare.com/）;網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape 3.6.0;分子對(duì)接軟件Autodock vina 1.1.2;PyMOL 2.3.2（https：//pymol.org/2/）;LigPlot 2.2（https：//www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/）。

1.2? 研究方法

1.2.1? 枸骨葉活性成分檢索與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)? 借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以“枸骨葉”為關(guān)鍵詞搜索活性成分，根據(jù)藥物ADME（吸收、分布、代謝及排泄）特性，選取生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，并根據(jù)文獻(xiàn)檢索增加枸骨葉中有明確藥理活性的主要成分，將檢索所得各個(gè)主要成分于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索相關(guān)靶點(diǎn)，對(duì)于未找到靶點(diǎn)的化合物從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中查找并下載2D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction在線數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，Swiss Target Prediction在線數(shù)據(jù)庫(kù)廣泛應(yīng)用于中藥作用機(jī)理和潛在治療靶點(diǎn)的研究[12]。剔除預(yù)測(cè)概率為“0”的靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)名稱輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中統(tǒng)一為規(guī)范基因名。

1.2.2? 疾病及相關(guān)基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)建立? 從GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)中以“cancer”為關(guān)鍵詞搜集腫瘤的疾病作用靶點(diǎn)，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Malignant Neoplasms”為關(guān)鍵詞搜索，得到的靶點(diǎn)合并去重后，將其導(dǎo)入EXCEL表格中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理以便后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3? 蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)模塊分析與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選? 將枸骨葉化合物預(yù)測(cè)得到的靶點(diǎn)與腫瘤疾病靶點(diǎn)求交集，將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件進(jìn)行可視化分析，確認(rèn)了PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶基因并進(jìn)行分析。

1.2.4? 分子對(duì)接? 選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的靶點(diǎn)蛋白，從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)下載蛋白三維結(jié)構(gòu)，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載化合物結(jié)構(gòu)，將準(zhǔn)備好的蛋白文件、配體文件、化合物文件以及腳本放入相應(yīng)文件夾，利用Autodock vina 1.1.2進(jìn)行半柔性對(duì)接。選取對(duì)接結(jié)合能量最低的構(gòu)象用于對(duì)接結(jié)合模式分析，并使用PyMOL2.3.2和LigPlot 2.2進(jìn)行作圖。

1.2.5? GO功能富集和KEGG通路富集? 將枸骨葉與腫瘤疾病的共有靶點(diǎn)映射到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集，從生物過(guò)程及信號(hào)通路角度分析枸骨葉治療腫瘤可能的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1? 枸骨葉活性成分與候選靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的枸骨葉化學(xué)成分56個(gè)，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18的原則，篩選出枸骨葉活性化合物10個(gè)，結(jié)合文獻(xiàn)查閱結(jié)果[13-15]，增加4個(gè)雖然OB、DL值較低，但含量較高并且有藥理活性的成分：齊墩果酸、羽扇豆醇、金絲桃苷、熊果酸納入研究。最終得到14個(gè)活性成分。見(jiàn)表1。

2.2? 枸骨葉抗腫瘤作用靶點(diǎn)及主要成分預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)平臺(tái)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)查找相關(guān)的化合物并進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，對(duì)相同靶點(diǎn)去重篩除，最終得到枸骨葉潛在的靶點(diǎn)信息259個(gè)。

2.3? 腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)基因的獲取

從GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)中以“cancer”為關(guān)鍵詞搜集腫瘤的疾病作用靶點(diǎn)，以score≥20作為疾病靶點(diǎn)篩選的標(biāo)準(zhǔn)，得到780個(gè)靶點(diǎn)，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中以“malignant neoplasms”為關(guān)鍵詞搜索，以EI≥1，score≥0.1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)得到955個(gè)靶點(diǎn)，將搜集到的靶點(diǎn)合并去重后，共獲得腫瘤靶點(diǎn)基因1 529個(gè)。將枸骨葉的靶基因與腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行映射，得到共同靶基因137個(gè)。

2.4? 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在Cytoscape 3.6.0軟件中導(dǎo)入共同靶基因，剔除非作用于腫瘤疾病相關(guān)靶點(diǎn)的化合物構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點(diǎn)150個(gè)，其中13個(gè)節(jié)點(diǎn)為活性成分（并非所有活性成分均可作用于腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)，剔除1個(gè)未作用于任何靶點(diǎn)的活性成分），共有137個(gè)節(jié)點(diǎn)為作用靶點(diǎn)，270條作用連線?？梢?jiàn)枸骨葉抗腫瘤具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.5? 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將枸骨葉與腫瘤的靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo sapiens”進(jìn)行操作，最低相互作用閥值設(shè)為高等“high confidence=0.7”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 3.6.0軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，最終116個(gè)基因參與了關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，包含了993個(gè)作用連線。見(jiàn)圖2。借助軟件中Network analyzer插件，分析網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，圓形節(jié)點(diǎn)的大小由其度值大小決定，度值越大，節(jié)點(diǎn)越大。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析顯示，全網(wǎng)平均度值為17.12，篩選度值≥30的核心靶點(diǎn)包括：TP53、MAPK1、STAT3、IL6、MAPK8、VEGFA、MYC、MAPK3、CCND1、EGF、EGFR、P90AA1、ESR1、CASP3、CXCL8、STAT1、RELA、FOS、PTGS2，提示枸骨葉抗腫瘤作用可能與這些靶點(diǎn)顯著相關(guān)。將這19個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白功能。見(jiàn)表2。表明枸骨葉抗腫瘤作用中有轉(zhuǎn)錄因子、酶和信號(hào)通路等相關(guān)蛋白物質(zhì)和信號(hào)通路的參與。

2.6? 分子對(duì)接結(jié)果及分析

利用AutoDock vina 1.1.2軟件，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中度值較大的3個(gè)靶蛋白（TP53、MAPK1、STAT3）與枸骨葉中預(yù)測(cè)靶點(diǎn)較多的5個(gè)成分進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接結(jié)果顯示（表3），分子與標(biāo)靶蛋白的最低結(jié)合能均小于0，說(shuō)明配體與受體均可以自發(fā)結(jié)合，其中長(zhǎng)梗冬青苷與P53、STAT3、MAPK1蛋白的對(duì)接結(jié)合能均小于-5 kcal·mol-1，結(jié)合能分別為-6.8、-6.7、-8.6 kcal·mol-1。將長(zhǎng)梗冬青苷與MAPK1的對(duì)接結(jié)果利用Pymol軟件繪圖，由圖可見(jiàn)，化合物的活性口袋中呈現(xiàn)出緊湊的結(jié)合模式?；衔锖偷鞍装被酖ly32、Glu33、Gly34、Tyr36、Gly37、Lys54、Val39、Ser153、

Leu156形成強(qiáng)烈的疏水性相互作用;與氨基酸Tyr113形成鍵長(zhǎng)為3.12?的氫鍵作用;與氨基酸Asp111形成鍵長(zhǎng)為3.28?的氫鍵作用;與氨基酸Asp167形成鍵長(zhǎng)為2.99?和2.89?的氫鍵作用，這些相互作用使得蛋白與化合物形成穩(wěn)定的復(fù)合物。見(jiàn)圖3。

2.7? 潛在靶點(diǎn)生物學(xué)功能分析

為了闡明枸骨葉抗腫瘤作用的分子機(jī)制，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其活性成分對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了GO和KEGG分析，GO功能注釋是通過(guò)生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類。設(shè)定統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)P<0.05，共富集到638條生物過(guò)程，對(duì)P值作檢驗(yàn)校正，選取生物過(guò)程、分子功能及細(xì)胞組分排名前15的基因分別做條形圖，由圖4可知，生物過(guò)程排名靠前的有DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等;分子功能主要富集在酶結(jié)合區(qū)、蛋白結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，主要涉及蛋白和轉(zhuǎn)錄因子活性;細(xì)胞組分分析中靠前的是胞液、胞外間隙、核質(zhì)、細(xì)胞核等，主要集中在胞液和細(xì)胞核上，反映了腫瘤發(fā)病涉及體內(nèi)多個(gè)生物過(guò)程的異常，同時(shí)表明枸骨葉可能是通過(guò)調(diào)節(jié)這些生物過(guò)程發(fā)揮其抗腫瘤作用。

KEGG通路分析得到枸骨葉抗腫瘤相關(guān)通路，分析排名前30條信號(hào)通路并作氣泡圖，得知枸骨葉主要富集在TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等。這些生物過(guò)程與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。見(jiàn)圖5。

3 討論

3.1? 腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制研究

遺傳和表觀遺傳的改變使得細(xì)胞逃避控制其存活和遷移的機(jī)制不斷增殖，導(dǎo)致癌癥的產(chǎn)生[16]。Hanahan等[17]根據(jù)現(xiàn)代腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，提出了腫瘤（hallmarks）學(xué)說(shuō)，包括維持增殖信號(hào)、逃避生長(zhǎng)抑制、避免免疫破壞、增強(qiáng)無(wú)限復(fù)制、癌性促炎反應(yīng)、激活侵襲轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)血管生成、基因組不穩(wěn)定與突變、細(xì)胞死亡抵抗、細(xì)胞能量代謝失衡等。其中MAPK、PI3K/Akt、mTOR、EGFR等促進(jìn)細(xì)胞周期，推動(dòng)細(xì)胞增殖，TP53、NF2、LKB1上皮極性蛋白可以逃逸抑癌蛋白R(shí)B的生長(zhǎng)抑制，此外，癌細(xì)胞還通過(guò)突變、促炎反應(yīng)、誘導(dǎo)血管生成等制造免疫抑制腫瘤微環(huán)境進(jìn)行增殖、向周邊浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移逃避免疫破壞。

3.2? 枸骨葉抗腫瘤的主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)探討

本研究得到的枸骨葉治療腫瘤的的成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖顯示槲皮素、山奈酚、異鼠李素、芒柄花黃素、長(zhǎng)梗冬青苷等14種化合物的連接度與介度較高，可作用于多個(gè)腫瘤靶點(diǎn)，提示這些成分可能是枸骨葉治療腫瘤的重要成分。王梓萱等[18]研究槲皮素能通過(guò)誘導(dǎo)P53非依賴性的G2/M細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用?，F(xiàn)代研究[19]表明，槲皮素可以調(diào)節(jié)與癌癥相關(guān)的多種miRNAs，包括let-7、miR-21、miR-146a和miR-155，從而抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展。張磊等[20]發(fā)現(xiàn)山奈酚能誘導(dǎo)三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）MDA-MB-231細(xì)胞中乳腺癌耐藥蛋白的表達(dá)并下調(diào)抗腫瘤藥物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷作用，還有研究[21-22]表明山奈酚可誘導(dǎo)G1期以下細(xì)胞聚集，并通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受體、Survivin凋亡抑制基因和ERα從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。朱琳等[23]體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)異鼠李素處理A549細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)表明異鼠李素通過(guò)下調(diào)bcl-2基因和PCNA蛋白表達(dá)，上調(diào)抑癌基因P53、bax及Caspase-3基因等來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也觀察到，異鼠李素在體內(nèi)也具有明顯的抗腫瘤作用，可顯著降低癌細(xì)胞增殖指數(shù)，誘導(dǎo)凋亡。李自全等[24]研究發(fā)現(xiàn)芒柄花黃素可抑制NSCLC細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡發(fā)生，可能通過(guò)下調(diào)Cyclin E1表達(dá)而影響細(xì)胞周期，并通過(guò)調(diào)控Bcl-2和Bax表達(dá)促使細(xì)胞凋亡發(fā)生。陳曦等[25]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)梗冬青苷可以抑制炎癥相關(guān)癌癥（colitis associated cancer， CAC）小鼠結(jié)腸miR-29a表達(dá)，上調(diào)miR-29a下游靶蛋白TET3的表達(dá)，同時(shí)抑制STAT3蛋白表達(dá)，可能是其干預(yù)CAC小鼠模型中結(jié)腸炎——癌病理發(fā)展的部分機(jī)制。還有研究[26]表明長(zhǎng)梗冬青苷可通過(guò)逆轉(zhuǎn)由miR-31-5p和miR-223-3p過(guò)表達(dá)而引起的Lats2和Apc的下調(diào)，顯著減輕DSS/AOM對(duì)小鼠腸道的損傷，從而預(yù)防CAC。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP53、MAPK1、STAT3、IL6、MAPK8、VEGFA、MYC、MAPK3、CCND1、EGF、EGFR等19個(gè)靶點(diǎn)是PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶蛋白。主要涉及TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等，結(jié)合KEGG通路分析結(jié)果得出，主要富集的癌種為前列腺癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、慢性骨髓白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。TP53是位于染色體17的短臂上的腫瘤抑制基因，通常調(diào)節(jié)細(xì)胞周期機(jī)制的活性。已觀察到P53基因的突變?cè)诙喾N類型的人類癌癥中具有高流行性，并且經(jīng)常伴隨點(diǎn)突變發(fā)生[27]。Zawlik等[28]研究表明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤經(jīng)常顯示TP53通路的基因改變，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，MDM2 SNP309 G等位基因和TP53密碼子72 Pro/Pro之間存在顯著相關(guān)性。MAPK1、MAPK8、MAPK3是MAP激酶家族的成員，又稱為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，是多種生物化學(xué)信號(hào)的整合點(diǎn)，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育等多種過(guò)程[29]。Chen等[30]研究證明MAPK1是miR-378的直接靶點(diǎn)，MAPK1的異位表達(dá)挽救了miR-378被抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，從而顯著降低了前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

本研究的分子對(duì)接結(jié)果提示，枸骨葉中的活性成分與TP53、MAPK1、STAT3有較好的親和力，其化合物抗腫瘤的作用需要進(jìn)一步的生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，基于對(duì)枸骨葉有效成分進(jìn)行的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了PPI研究，以及GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)枸骨葉中對(duì)應(yīng)核心靶點(diǎn)較多的成分有槲皮素、芒柄花黃素、長(zhǎng)梗冬青苷、熊果酸等，這些成分可能是枸骨葉發(fā)揮抗腫瘤的潛在活性成分。我們推測(cè)，枸骨葉抗腫瘤作用是多化合物、多靶點(diǎn)、多途徑的直接或間接協(xié)同作用的結(jié)果。本研究為將來(lái)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及進(jìn)一步探索提供了依據(jù)，后續(xù)將通過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證枸骨葉的抗腫瘤藥理活性作用，并進(jìn)行枸骨葉中多種化合物的協(xié)同作用等方面的相關(guān)研究。

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