基于電子鼻、頂空氣相色譜-離子遷移譜分析比較不同殺菌處理紫米甜酒釀中的揮發(fā)性成分

彭旭怡，鄭經紹，劉宇航，許琳浣，匡維陽，黃葦

（1.華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642）（2.新興縣微豐農業(yè)科技有限公司，廣東新興 527400）

紫米甜酒釀酸甜可口、別有風味，且富含花色苷、酚類、B族維生素等生物活性物質，具有益氣生津、抗氧化、抗炎等保健功效，深受廣大老百姓的喜愛[1-3]。紫米甜酒釀常溫保質期短，需要通過殺菌以延長保質期，但不同的殺菌工藝會導致甜酒釀的風味成分發(fā)生不同程度變化。市售甜酒釀多是采用加熱殺菌工藝，有研究報道，加熱處理的方式可能會分解樣品中的某些熱敏性香氣成分、造成小分子物質逸散以及生成不良味道[4]，從而影響甜酒釀的風味和口感。目前關于甜酒釀的研究主要集中在甜酒曲的優(yōu)化篩選[5,6]，發(fā)酵工藝的優(yōu)化等方面[7,8]，有關殺菌方式對紫米甜酒釀香氣成分的影響鮮見報道。明確不同殺菌方式對甜酒釀香氣和風味的影響，有利于探索適宜的殺菌保藏方法，在保證貨架期的前提下，最大化保持紫米甜酒釀的風味品質。

電子鼻是90年代發(fā)展起來的一種基于模擬人類嗅覺系統(tǒng)的揮發(fā)性成分分析儀器，具有操作簡單、快速無損，重復性好的特點，可以對不同樣品氣味輪廓的細微差異進行區(qū)分，但其無法定性定量分析某一種揮發(fā)性成分[9]。頂空氣相色譜-離子遷移色譜（ Headspace gas Chromatograph-Ion Mobility Spectrometer，HS-GC-IMS）是基于氣相保留時間和離子遷移時間的差異，來區(qū)分揮發(fā)性化合物的新型分析技術，具有前處理簡單，香氣無需濃縮和富集，靈敏度高，可檢測痕量揮發(fā)性物質，分析速度快的特點[10]。

本研究結合采用電子鼻、HS-GC-IMS兩種風味分析技術對不同殺菌處理（未殺菌對照、熱殺菌、輻照殺菌、超高壓殺菌）的紫米甜酒釀?chuàng)]發(fā)性風味成分進行全面檢測分析，探究不同殺菌方式對風味成分變化的影響規(guī)律，為以期為甜酒釀殺菌方式的選擇提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫米（糙米），廣東云浮市新興微豐農業(yè)科技有限公司；根霉甜酒種，廣東省肇慶市高要區(qū)粵桂酒餅菌種廠；食品級尼龍氯化聚丙烯復合材質（PA+CPP）塑料袋，喜之龍包裝有限公司。

1.2 儀器與設備

電子鼻，德國Airsense公司；FlavourSpec?風味分析儀，德國G.A.S公司；800 MPa雙容器食品超高壓裝置，包頭文天科技有限責任公司；IS10/20型電子直線加速器，同方威視技術股份有限公司；真空包裝機，東莞市青葉包裝機械有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫米甜酒釀的釀造及殺菌流程

工藝流程[11]：

紫米→清洗→蒸煮→冷卻→接種酒曲→拌勻搭窩→糖化發(fā)酵至終點→包裝→殺菌→成品

1.3.2 殺菌方法

將甜酒釀混勻，分裝于塑料袋中每袋100 g，真空包裝后，按照前期優(yōu)化的殺菌工藝，進行相應的殺菌處理。熱殺菌：100 ℃加熱處理20 min；超高壓殺菌：600 MPa保壓20 min；輻照殺菌：輻照劑量9 kGy。上述殺菌樣品經理化及微生物指標檢測，均達到軟罐頭國家標準。

1.3.3 電子鼻檢測

PEN3型電子鼻由10種金屬氧化物氣體傳感器陣列組成，如表1所示。準確稱取10 g甜酒釀樣品于40 mL頂空瓶中，40 ℃水浴密封靜置30 min，隨后插入電子鼻探頭吸取頂端氣體，測定揮發(fā)性物質。電子鼻參數(shù)[12]：采樣間隔1 s，沖洗時間120 s，調零時間10 s，預采樣時間5 s，檢測時間120 s，載氣流速、進樣流速300 mL/min，每種樣品重復測定6次。檢測時傳感器于107 s后趨于平穩(wěn)，因此選取108 s時的響應值進行分析。

表1 PEN3電子鼻傳感器敏感物質Table 1 Sensitive substances of PEN3 electronic nose sensor

1.3.4 HS-GC-IMS分析

參考Li Siying等[13]的方法并稍作修改。精密稱取1 g樣品置于20 mL頂空瓶中，60 ℃孵化20 min，頂空進樣，進樣量100 μL，不分流。

GC條件：色譜柱類型為WAX，長15 m，內徑0.53 mm，膜厚1 μm，柱溫60 ℃，載氣為N2；載氣流速，0～2 min，保持2 mL/min；2～10 min，從2 mL/min上升至10 mL/min；10～20 min，從10 mL/min上升至100 mL/min；20～40 min，保持100 mL/min。

IMS條件：漂移管的溫度為45 ℃；漂移氣為N2；漂移氣流速為150 mL/min。

1.3.5 相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）

參考文獻[14]，引入參數(shù)ROAV，評價各化學物對紫米甜酒釀風味的貢獻，設定對樣品風味貢獻最大化合物：ROAVmax=100，其他化合物計算公式如下：

式中：Ci、Ti分別為各化合物的相對百分含量和對應的感覺閾值；Cmax、Tmax分別為對樣品風味貢獻最大組分的相對百分含量和感覺閾值。

1.4 數(shù)據分析

使用Excel 2019統(tǒng)計數(shù)據；使用SPSS 26.0進行數(shù)據的顯著性分析；使用軟件Winmuster進行電子鼻數(shù)據的載荷分析和LDA分析；使用GC-IMS儀器配套的軟件LAV（labo-ratory analytical viewer）及4款插件Reporter、GalleryPlot、Dynamic PCA、Nearest Neighbor對樣品揮發(fā)性化合物進行分析。

2 結果與分析

2.1 電子鼻分析不同殺菌處理紫米甜酒釀中的揮發(fā)性成分

2.1.1 傳感器響應值變化分析

電子鼻傳感器對4組樣品的揮發(fā)性成分的響應信號如圖1，可知，10種傳感器對樣品揮發(fā)性成分的響應程度不同，傳感器R6（W1S）、R7（W1W）、R2（W5S）、R8（W2S）、R9（W2W）的響應信號普遍較強，響應值（G/G0）在25～60之間，它們分別對甲基類、硫化物、氮氧化合物、醇和醛酮、芳香成分比較敏感。其他傳感器對樣品的響應值較小，在0～5之間，表明電子鼻對樣品中芳烴成分、苯類、芳香成分、氨類、氫類、短鏈烷烴、長鏈烷烴等物質的響應不敏感或該類物質含量較低，這與林俊帆[15]使用電子鼻對黑米米飯香氣特性研究的結果基本一致。各組樣品揮發(fā)性成分對傳感器的敏感性大致相同，但響應值有所差異，R6顯示樣品經過加熱和輻照殺菌，響應值顯著下降（p＜0.05），R2、R7、R8分別顯示樣品經不同方式殺菌后，響應值顯著上升（p＜0.05）。表明，經不同殺菌處理的樣品存在揮發(fā)性成分的變化，而這些變化會影響紫米甜酒釀的整體風味。

圖1 不同殺菌樣品揮發(fā)性成分的傳感器響應值Fig.1 Sensor response value of volatile components of different sterilization samples

2.1.2 傳感器區(qū)分貢獻率分析

在載荷分析圖中，各個傳感器的坐標位置可以準確表示其對樣品區(qū)分貢獻率的大小，與坐標原點距離越遠，對樣品區(qū)分貢獻率就越大，反之則越小[16]。由圖2可知，R2（W5S）、R8（W2S）、R6（W1S）、R7（W1W）距離原點較遠，可知電子鼻區(qū)分不同殺菌甜酒釀的關鍵風味物質為氮氧化合物、醇和醛酮、甲基類、硫化物成分，這與傳感器響應值分析結果相一致。

圖2 不同殺菌樣品電子鼻傳感器載荷分析圖Fig.2 Load analysis diagram of electronic nose sensor for different sterilization samples

2.1.3 電子鼻線性判別分析LDA分析

LDA是有監(jiān)督降維分析方法，目的是將數(shù)據降維成不存在信息交叉的新數(shù)據并依然基本保留樣品的全部信息，使復雜的數(shù)據變得簡單明了，LDA分析注重同類別數(shù)據在空間中的分布狀態(tài)及彼此之間的距離，希望投影后數(shù)據組內方差小，而組間方差大，使不同類別的數(shù)據盡可能分開[17]，性質相似的樣品在空間距離上會接近。

由圖3可看出，第一主成分（PC1）的貢獻率為63.60%，第二主成分（PC2）的貢獻率為33.09%，PC1與PC2貢獻率之和為96.69%，幾乎反映了樣品全部信息，且4組樣品之間無交叉區(qū)域，區(qū)分明顯，說明樣品經過加熱、輻照、超高壓殺菌后風味成分發(fā)生改變。從各組樣品之間的空間距離來看，超高壓殺菌與未殺菌對照樣品的距離最為接近，加熱、輻照殺菌與未殺菌對照樣品之間的距離較大，說明超高壓殺菌樣品的風味成分與對照組最為接近，超高壓殺菌有利于保留樣品原風味成分，這與徐增慧[18]等人研究高靜壓和熱殺菌對桃汁香氣成分的影響的結論一致，而加熱、輻照殺菌樣品風味成分與對照組相差較遠，明顯改變了甜酒釀原風味。

圖3 不同殺菌樣品電子鼻LDA分析圖Fig.3 LDA analysis diagram of electronic nose with different sterilization samples

但電子鼻檢測分析僅能得到樣品揮發(fā)性成分的整體輪廓，顯示不同殺菌處理對紫米甜酒釀?chuàng)]發(fā)性成分的響應信號有差異，但不能明確具體的成分，因此本研究進一步采用了HS-GC-IMS技術對樣品的揮發(fā)物成分的具體物質構成進行測定與分析。

2.2 HS-GC-IMS分析不同殺菌處理紫米甜酒釀中的揮發(fā)性成分

2.2.1 紫米甜酒釀?chuàng)]發(fā)性化合物的鑒定和分析

按照1.3.4中的條件通過GC×IMS Library Search軟件內置數(shù)據庫，對紫米甜酒釀?chuàng)]發(fā)性化合物進行定性定量分析，在4種處理的紫米甜酒釀中鑒定出共同具有的揮發(fā)性物質42種（51個峰42種化合物見表2），其中10種醇類、16種酯類、5種醛類、5種酮類、4種酸類、1種烯烴類和1種烷烴類共7大類（統(tǒng)計見表3）。由表3可知，相對含量最高的是醇類，占總體揮發(fā)性成分的 62.03%～65.73%，其次是酯類（12.7%～13.93%）、酮類（9.36%～11.59%）、醛類（6.57%～7.26%）、酸類（3.02%～4.60%）、烷烴類（0.39%～0.56%）、烯烴類（0.10%～0.24%）。醇類和酯類是紫米甜酒釀中最重要的揮發(fā)性成分，這與蘇佳佳等[7]、高瑩瑩等[19]的研究結果一致。不同殺菌方式使得紫米甜酒釀中揮發(fā)性風味成分相對含量發(fā)生不同程度的變化。

表2 紫米甜酒釀中鑒定出的揮發(fā)性化合物相對含量Table 2 Relative content of volatile compounds identified in purple rice sweet wine

表3 主要的揮發(fā)性有機化合物種類和相對含量Table 3 types and relative contents of main volatile organic compounds

接上頁

醇類物質可以襯托酯香，促進香氣協(xié)調，是樣品的主要香氣成分[20]。殺菌前后樣品中相對含量最高的醇類物質均為乙醇、異戊醇、異丁醇，三者之和為51.43%～57.74%，超過揮發(fā)性成分相對含量總和一半，與蘇佳佳[7]研究糙米甜酒釀香氣成分的結果吻合。經熱殺菌的樣品中的醇類總體相對含量較未殺菌的樣品增加了0.26%，可能是加熱使得某些以糖苷健結合的醇類釋放，以及氨基酸的去氨基和去碳酸基反應，從而使得醇類有所增加[21]。經過輻照殺菌樣品醇類相對含量減少了3.45%，其中乙醇減少了2.54%，異戊醇減少了0.58%，說明輻照殺菌處理會降低樣品中醇類的含量，與張滿滿等[22]研究的電子束輻照陳化小曲白酒的醇類變化趨勢一致。樣品經超高壓處理醇類含量減少了1.55%，其中乙醇減少了0.86%，可能和醇類與酸類物質發(fā)生酯化反應形成酯類化合物有關[23]，醇類含量降低，可以減少酒精帶來的刺激感，使酒體變的柔和。殺菌處理使得樣品醇類物質相對含量發(fā)生不同程度的增加或減少。

酯類物質一般具有愉悅，怡人的果香。未殺菌樣品中含量相對較高的酯類物質為乙酸乙酯（6.38%）、異丁酸乙酯（1.14%）、乙酸異戊酯（1.13%）。經過熱殺菌，樣品中酯類總體相對含量減少了1.31%，其中，異丁酸乙酯（0.77%），乙酸異戊酯（0.69%）相對含量均有不同程度的下降，加熱處理使得部分酯類風味損失，可能原因是高溫下酯類發(fā)生水解，這與吳瓊[24]等對熱殺菌處理的桑葚汁香氣成分的酯類變化情況研究結果相吻合。經過輻照殺菌，不同酯類物質相對含量分別發(fā)生了不同程度的增加或減少，總體相對含量增加了0.53%，樣品中主要酯類成分有乙酸乙酯、丙酸乙酯、異丁酸乙酯、異戊酸甲酯（相對含量＞1%），與謝彥岑[25]等研究的白酒輻照加速陳化實驗酯類香氣變化情況結果一致。經過超高壓殺菌，酯類總體相對含量增加了0.55%，樣品主要酯類成分有乙酸乙酯、異戊酸甲酯、乙酸丙酯、異丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丙酸乙酯（相對含量＞1%）。經過殺菌的樣品與對照組相比，相對含量＞1%的酯類種類發(fā)生了變化，相對含量較高的酯類物質均為乙酸乙酯（5.86%～6.40%）。紫米甜酒釀經熱殺菌處理酯類香氣成分發(fā)生損失，經輻照、超高壓殺菌處理酯類成分有不同程度的增加。

醛類風味閾值較低，風味特征明顯[26,27]，紫米甜酒釀中共檢測出5種，主要包括乙醛和丁醛，經過不同的殺菌處理，醛類總體相對含量都有不同程度下降。未殺菌樣品中乙醛含量為5.25%，經過熱處理下降到5.05%，經過輻照處理下降到4.82%，經過超高壓處理下降到5.15%。未殺菌丁醛含量為1.24%，經過熱處理下降到1.18%，經過輻照處理下降到0.97%，經過超高壓處理下降到1.19%。

酮類也是樣品香氣的重要組成部分[28]，共檢測出5種，主要包括丙酮、2-丁酮、2-戊酮（＞1%）。未殺菌樣品酮類相對含量為9.47%，經熱殺菌下降至9.36%，經過輻照殺菌增加至11.59%，經過超高壓殺菌增加至9.94%。

樣品中酸類物質共檢測出4種，主要為乙酸和異丁酸，帶有不愉快的氣味，未殺菌樣品酸類相對含量為3.02%，經過不同殺菌處理后，酸類成分都有不同程度的增加。

樣品中檢測出的烯烴類為檸檬烯，未殺菌樣品百分含量為0.12%，經過熱殺菌、超高壓殺菌有不同程度增加，經輻照殺菌相對含量下降。檢測到的烷烴類為丙烷，未殺菌樣品百分含量為1.14%，經過不同殺菌處理，都有不同程度的下降。

2.2.2 氣相色譜離子遷移譜（GC-IMS）差異對比圖

圖4 為不同殺菌處理的紫米甜酒釀?chuàng)]發(fā)性成分GC-IMS差異對比圖，差異對比圖能夠使各組樣品間揮發(fā)性成分的差異可視化。圖中縱坐標表示GC分離時化合物的保留時間，橫坐標表示IMS分離時化合物相對于反應離子峰（RIP）的遷移時間，橫坐標1.0處豎線表示RIP峰，RIP峰兩側的每個點代表一種揮發(fā)性成分。以未經殺菌處理的樣品氣味指紋譜圖作為參比，其他不同殺菌處理樣品的譜圖扣除參比，若二者揮發(fā)性成分及含量一致，則扣減后的背景為白色，若對應成分的含量高于參比則顯示紅色，紅色越深，差異越大；若對應成分含量低于參比則顯示藍色，藍色越深，差異越大。由熱殺菌的黑框區(qū)域可看出，有大量深藍色點，很少的淺紅色點，表明經過熱殺菌樣品中較多物質的量出現(xiàn)明顯損失，含量下降。由輻照殺菌的紅框區(qū)域可看出，出現(xiàn)大量的深藍色點和紅色點，且顏色較深，表明經輻照殺菌后，樣品中一些物質含量出現(xiàn)明顯減少，另一些明顯增加，與對照組在揮發(fā)性成分量的構成上差異明顯。由超高壓滅菌的藍框區(qū)域可看出，藍點和紅點的數(shù)量少，顏色較淺，白色區(qū)域相對較多，表明經超高壓殺菌后揮發(fā)性成分的變化相對較小。顯示三種殺菌方式中，超高壓殺菌在保持紫米甜酒釀原有揮發(fā)性香氣成分方面，優(yōu)于熱殺菌和輻照殺菌。與電子鼻檢測數(shù)據的LDA分析結果相一致。

圖4 不同殺菌方式處理的樣品的GC-IMS差異對比圖Fig.4 Comparison of GC-IMS differences of samples treated by different sterilization methods

2.2.3 不同殺菌處理的樣品的最近鄰算法分析使用儀器軟件自帶的Nearest Neighbor最近鄰算法分析插件對GC-IMS的測定結果進行分析，可以更加直觀地判別區(qū)分不同殺菌樣品之間的差異。最近鄰算法是根據化合物的強度對樣本進行快速比較，計算每兩個樣本的之間的歐幾里得距離，檢索最小距離來找到“最近鄰”，底部顏色區(qū)域顯示每個類的正態(tài)分布，歐幾里得距離越近，相似度越高。分析結果見圖5，超高壓殺菌與未殺菌樣品的歐幾里得距離最近，相似度最高，其次是輻照殺菌，熱殺菌距離最遠。表明，經超高壓殺菌處理后，紫米甜酒釀?chuàng)]發(fā)性成分變化最小，能較好保持原樣品的風味。紫米甜酒釀經輻照殺菌、熱殺菌后揮發(fā)性成分變化明顯。該結果與電子鼻檢測的LDA分析，GC-IMS差異對比圖譜分析相一致。

圖5 不同殺菌方式處理的樣品的最近鄰算法距離圖Fig.5 Distance diagram of nearest neighbor algorithm for samples treated by different sterilization methods

2.2.4 紫米甜酒釀樣品關鍵揮發(fā)性化合物分析

揮發(fā)性成分可以通過積累、協(xié)同、抑制和掩蔽等作用，使得香氣復雜多變[29]，ROAV（相對氣味活性值）可用于表征揮發(fā)性化合物對樣品總體香氣的貢獻，ROAV≥1的成分為該樣品關鍵性風味化合物，直接影響樣品總體風味，ROAV值越大，對樣品風味的貢獻率越大，0.1≤ROAV＜1的成分為該樣品修飾性風味化合物，修飾樣品總體風味[30]。紫米甜酒釀中所有揮發(fā)性物質的閾值和香氣描述參考相關文獻[31-33]，根據式（1）計算得到得ROAV值。如表4可知，紫米甜酒釀中已定性揮發(fā)性化合物中ROAV≥0.1有18種化合物，對紫米甜酒釀的香氣貢獻較大。其中，4組樣品中ROAV值大于1的風味化合物均有12種，共有的關鍵性風味化合物11種，分別為2-甲基丁酸乙酯、乙醛、異戊酸乙酯、異戊醇、丁醛、異丁酸乙酯、乙酸異戊酯、戊醛、3-甲基丁酸、2-庚酮、己酸乙酯，賦予樣品花果香和醇香，風味化合物種類相似，但貢獻度差異較大。對不同殺菌樣品ROAV值與對照樣品相比差異大于1的化合物進行分析，熱殺菌樣品中有6種化合物ROAV值變化大于1,2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸異戊酯ROAV值分別下降了30.61、9.07、3.96、2.35，異戊醇ROAV值下降了8.13，乙醛ROAV值下降了1.6，樣品整體風味出現(xiàn)果香花香味、辛辣酒味減弱。輻照殺菌樣品中有7種化合物ROAV值變化大于1，異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、異丁酸乙酯ROAV值分別下降了4.27、1.87、1.39，異戊醇ROAV值下降了8.18，乙醛、丁醛ROAV值下降了3.44、3.93，戊醛ROAV值上升了2.27，樣品整體風味也出現(xiàn)果香花香味、辛辣酒味減弱，減弱程度較熱殺菌樣品低。超高壓殺菌樣品中異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、2-甲基丁酸乙酯ROAV值分別下降了6.41、3.00、1.02，異戊醇ROAV下降了8.15，樣品整體風味也出現(xiàn)果香花香味、辛辣酒味減弱，樣品ROAV值變化大于1的風味化合物種類為3種，少于加熱、輻照殺菌樣品。推斷四種樣品的風味差異主要來源于關鍵風味化合物的貢獻度不同。

表4 紫米甜酒釀中已定性揮發(fā)性化合物的ROAV值Table 4 ROAV values of identified volatile compounds in purple rice sweet wine

3 結論

本文結合電子鼻、HS-GC-IMS兩種技術，分析鑒定了熱殺菌、輻照殺菌、超高壓殺菌處理及未殺菌對照樣品紫米甜酒釀的揮發(fā)性香氣成分。通過對電子鼻傳感器響應值分析，顯示傳感器R6（甲基類）、R7（硫化物）、R2（氮氧化合物）、R8（醇和醛酮）、R9（芳香成分）對不同殺菌樣品均有較高的響應值；LDA分析能對對四種樣品有很好的區(qū)分，顯示超高壓與未殺菌樣品的揮發(fā)性成分最相似，輻照殺菌、熱殺菌明顯改變了樣品的原風味輪廓。HS-GC-IMS結果顯示不同殺菌樣品共同定性定量出10種醇類，16種酯類，5種醛類，5種酮類，4種酸類，1種烯烴類，1種烷烴類共42種，7大類揮發(fā)性成分，其中醇類、酯類的種類最豐富，相對含量最高。殺菌方式對樣品揮發(fā)性化合物種類構成影響較小，而對相對含量有明顯影響，熱殺菌處理使得樣品的醇類、酸類、烯烴類物質含量的增加，酯類、醛類、烷烴類物質的減少。輻照殺菌和超高壓殺菌均使得酯類、酮類、酸類、烷烴類物質增加，醇類、醛類減少。通過GC-IMS差異對比圖和最鄰近算法聚類分析，直觀顯示超高壓殺菌與未殺菌對照樣品風味成分最相似，其余兩種殺菌方式則明顯改變了樣品原有的風味物質，與電子鼻分析結果相一致。ROAV值顯示不同殺菌樣品的風味差異主要來源于關鍵性風味化合物的貢獻度不同。通過電子鼻與HS-GC-IMS兩種技術檢測結果，從宏觀和微觀上分析紫米甜酒釀不同殺菌及未對照樣品揮發(fā)性香氣成分的差異，確定超高壓殺菌是紫米甜酒釀優(yōu)選的殺菌方式，并為關鍵風味化合物綜合評價方法提供參考。