毛酸漿乳酸菌發(fā)酵果汁的體外消化耐受性及抗氧化活性變化

鞠葛金悅，徐紅雨，溫靖，吳繼軍，余元善，李璐，田書源，王晶晶

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121001）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）

毛酸漿（Physalis pubescenceL.）為茄科酸漿屬一年生草本植物，俗稱洋菇娘或黃菇娘，是東北特色漿果。富含營養(yǎng)物質(zhì)和功能活性成分，毛酸漿中的黃酮類、甾體類、苯丙素類、生物堿類、脂肪酸類等多種化學(xué)成分具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、利尿、免疫抑制等多種藥理活性，近些年在國內(nèi)受到部分學(xué)者關(guān)注，但鮮有國外學(xué)者對其進(jìn)行研究[1-4]。

近年來，乳酸菌作為益生菌重要的組成部分受到越來越多研究者們的關(guān)注，利用乳酸菌對這些腸道疾病的預(yù)防作用制成口感鮮美的發(fā)酵型果汁，即有利于人體腸道健康，又滿足了人們的飲食需要。利用乳酸菌對果蔬進(jìn)行發(fā)酵，能將乳酸菌的益生功能與果蔬的營養(yǎng)功能有效的結(jié)合起來，還能夠賦予果蔬新的風(fēng)味，提高生物活性[5,6]。乳酸菌可定植于人腸道內(nèi)發(fā)揮其生理功能，而其在腸道中的定植能夠改善人體腸道菌群的構(gòu)成，起到抑制致病菌，維持腸道生態(tài)環(huán)境的平衡[7,8]。因此，對消化環(huán)境的耐受力是篩選發(fā)酵果蔬汁的益生菌重要的標(biāo)準(zhǔn)之一。食物通過胃腸消化進(jìn)入人體從而影響人體健康，徹底理解消化過程中食物發(fā)生的變化，對于理解生物利用率和生物活性至關(guān)重要。在過去十年中，對于胃腸道消化食物過程的研究逐漸增多[9]。在理想情況下，食物消化應(yīng)該在人體內(nèi)進(jìn)行研究，但體內(nèi)消化消化實(shí)驗(yàn)具有高費(fèi)用、高耗時(shí)以及較大個(gè)體差異等特點(diǎn)，而體外模擬消化與之相比較為便捷、快速、成本低、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[10]。體外模擬胃腸道環(huán)境實(shí)驗(yàn)，可為篩選更易定植于腸道、激發(fā)發(fā)酵果汁中抗氧化能力的乳酸菌提供理論依據(jù)。

本文分別采用植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌對毛酸漿果汁進(jìn)行發(fā)酵，通過檢測發(fā)酵果汁經(jīng)過體外模擬胃液和腸液后乳酸菌的存活率、果汁多酚含量和抗氧化性的變化，評價(jià)了毛酸漿發(fā)酵果汁的體外消化耐受性及生物活性變化，為毛酸漿乳酸菌發(fā)酵果汁的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛酸漿，購于遼寧省錦州市。

發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermenti）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；水溶性VE（Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-amino-di (3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6) ammonium salt，ABTS），美國Sigma-Aldrich公司；豬胃白酶（酶活力3200 U/mg）、豬胰蛋白酶（酶活力4～6 U/mg）、豬膽鹽、Folin-Ciocalteu試劑，上海源葉生物科技有限公司；甲酸、甲醇（均為色譜純），德國Meker公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型分光光度計(jì)、LC-20A HPLC儀，日本島津公司；pH計(jì)PB-10，德國Sartorius；恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱、立式蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific公司。ALC-210.4分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SYNERGY H1多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵毛酸漿果汁的制備

1.3.1.1 菌株活化

從-80 ℃冰箱中取出凍存菌株，取500 μL甘油菌于50 mL滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，取菌液接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。取活化后的單菌落接種于10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。

1.3.1.2 毛酸漿果漿制備

選取新鮮成熟完整的毛酸漿果，去萼，清洗，瀝干后放入榨汁機(jī)中打漿，過濾，果汁經(jīng)巴氏殺菌，放置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.1.3 乳酸菌發(fā)酵毛酸漿果汁

將發(fā)酵乳桿菌及植物乳桿菌以1.0×106.5CFU/mL的接種量接入到毛酸漿果汁中，37 ℃發(fā)酵48 h，即可得到乳酸菌發(fā)酵毛酸漿果汁。

1.3.2 模擬體外消化體系

1.3.2.1 模擬胃液消化試驗(yàn)

制備PBS緩沖溶液，用稀鹽酸分別調(diào)節(jié)pH值到1.5、2.0、3.0及4.0。121 ℃高壓滅菌30 min后，分別添加10.0 g/L胃蛋白酶，溶解后用無菌0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。將毛酸漿發(fā)酵果汁以10%（V/V）的添加量添加至人工胃液中，置于37 ℃、100 r/min恒溫?fù)u床進(jìn)行消化，2 h后取樣檢測乳酸菌、多酚和抗氧化指標(biāo)。

1.3.2.2 模擬腸液消化試驗(yàn)

制備PBS緩沖溶液，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5。121 ℃高壓滅菌后添加10.0 g/L胰蛋白酶，充分溶解，用無菌0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。將發(fā)酵毛酸漿果汁以10%（V/V）的添加量添加至人工腸液中，放置37 ℃、100 r/min恒溫?fù)u床進(jìn)行消化，分別于0、1、2、3、4 h時(shí)進(jìn)行取樣，檢測乳酸菌、多酚和抗氧化指標(biāo)。

1.3.2.3 模擬膽鹽液試驗(yàn)

取MRS肉湯培養(yǎng)基，分別以0、1、2、3、4 g/L的濃度將膽鹽添加至MRS肉湯培養(yǎng)基中，121 ℃滅菌。將發(fā)酵毛酸漿果汁添加至模擬膽鹽液，于24 h后進(jìn)行取樣，檢測乳酸菌菌落總數(shù)。

1.3.2.4 模擬胃腸道體系試驗(yàn)

參考Zhuang Guo和Megda Silva Fernandes等方法，稍作改進(jìn)[11,12]。配置pH為3.0的人工胃液，配置加有3 g/L膽鹽的人工腸液，用無菌0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。將發(fā)酵毛酸漿果汁按10%（V/V）的添加量添加至人工胃液中，放置37 ℃、100 r/min恒溫?fù)u床消化2 h。然后，從上述已消化2 h的人工含菌胃液取1 mL，加入到已加入3 g/L膽鹽的9 mL人工腸液中，在37 ℃、100 r/min的恒溫?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)。在第0、2、4、6、8、10 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，檢測乳酸菌、多酚和抗氧化指標(biāo)。

1.3.3 消化后果汁提取物的制備

取經(jīng)過模擬胃液、腸液及消模擬胃腸道環(huán)境消化后的果汁1 mL，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的酸化甲醇水溶液，超聲30 min后，15000 r/min離心20 min，收集提取液，檢測多酚和抗氧化指標(biāo)。

1.3.4 乳酸菌菌落數(shù)的測定

參考國標(biāo)GB 4789.35-2016的方法進(jìn)行乳酸菌菌落數(shù)的測定[13]。

1.3.5 多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu檢測法[14]。取稀釋后的樣品1 mL，加入2 mL Folin-Ciocalteu溶液，再加入2 mL 10% Na2CO3溶液，室溫條件下避光1 h，于760 nm處測定吸光值。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 清除DPPH自由基能力的測定

參考Sokolletowska等[15]的方法進(jìn)行。取適當(dāng)稀釋后的樣品50 μL，加入150 μL，濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液，混勻，室溫條件下避光反應(yīng)20 min，用酶標(biāo)儀測定波長517 nm處的吸光度。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，測定不同質(zhì)量濃度的Trolox對DPPH自由基的清除率，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品對DPPH自由基清除能力以Trolox當(dāng)量表示，以鮮質(zhì)量計(jì)。DPPH清除率按公式（1）計(jì)算。

式中：A1為對照組吸光度；A0為試劑空白組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為樣品空白組吸光度。

1.3.7 樣品ABTS+·能力的測定

參考Re等[16]的方法略作修改。將7 mmol/L的ABTS溶液（50 mL）與0.88 mL 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，形成ABTS儲備液。取適當(dāng)稀釋后的樣品10 μL，加入200 μL ABTS溶液，旋渦振蕩30 s后，在室溫條件下避光反應(yīng)6 min，用酶標(biāo)儀測定波長734 nm處吸光度。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，測定不同質(zhì)量濃度的Trolox對ABTS+·的清除率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品ABTS+·清除率按公式（1）計(jì)算。

1.3.8 三價(jià)鐵離子還原能力的測定

參考田燕等[17]的方法進(jìn)行。取適當(dāng)稀釋后的樣品1 mL，加入0.2 mL 0.2 mol/L PBS（pH 6.6）和1.5 mL 0.3%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃孵育20 min，迅速冷卻，加入l mL 10%的三氯乙酸，混勻后3000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，加入0.5 mL 0.3%三氯化鐵溶液混勻，再加3 mL純水，搖勻，測定波長700 nm處的吸光度。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品的鐵離子還原能力以Trolox當(dāng)量表示，以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，一元方差分析，以Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用Origin 2017軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 果汁中乳酸菌體外消化耐受力分析

2.1.1 胃液pH值的影響

胃液對于乳酸菌是一個(gè)極其嚴(yán)峻的生存環(huán)境，探究胃液耐受性對于乳酸菌的篩選具有重要意義[18]。通常空腹時(shí)人體內(nèi)胃環(huán)境pH在1.3～2.0之間，由于食物的緩沖能力不同，食物的攝入會將胃的pH調(diào)節(jié)至4.5及以上[19,20]。同時(shí)也有研究表明，食物在胃中的排空時(shí)間與食物的物理性質(zhì)相關(guān)，流體食物的排空時(shí)間一般在1～2 h[21]。因此，選取pH為1.5、2、3、4，消化時(shí)間為2 h的條件下對進(jìn)行試驗(yàn)。圖1a提示，胃液pH與毛酸漿中乳酸菌殘存量呈正相關(guān)（p＜0.05）。毛酸漿果汁經(jīng)pH為1.5、2、3、4的胃液消化2 h后，果汁中植物乳桿菌從8.87 CFU/mL分別下降為5.30 CFU/mL、7.76 CFU/mL、7.85 CFU/mL和7.89 CFU/mL；發(fā)酵乳桿菌的菌落總數(shù)從15 CFU/mL分別下降為5.30 CFU/mL、8.02 CFU/mL、8.04 CFU/mL和8.09 CFU/mL。關(guān)小鶯等[22]對干酪乳桿菌發(fā)酵荔枝汁進(jìn)行模擬消化，也發(fā)現(xiàn)胃液pH下降，乳桿菌的活菌數(shù)也隨之下降。與本文研究結(jié)果一致。但毛酸漿中發(fā)酵乳桿菌及植物乳桿菌在pH為1.5的胃酸環(huán)境中的耐受力強(qiáng)于關(guān)小鶯等所研究的干酪乳桿菌。pH過低的環(huán)境下會破壞乳酸菌的自我保護(hù)機(jī)制，是降低乳酸菌菌落數(shù)的原因之一[23]。

圖1 毛酸漿發(fā)酵果汁模擬胃液、腸液、膽鹽液及胃腸消化過程中菌落總數(shù)的變化Fig.1 The viable counts of ferment Physalis pubescens L. juice in artificial gastric juice, artificial intestinal juice, artificial bile salt and simulated gastrointestinal digestion

2.1.2 腸液消化時(shí)間的影響

在空腸及十二指腸中膽鹽濃度為1～5 g/L[24]。因此試驗(yàn)?zāi)扄}濃度設(shè)置為0～4 g/L，消化時(shí)間1～4 h的耐受力，每小時(shí)取樣一次進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。圖1b提示，在消化1 h后植物乳桿菌與發(fā)酵乳桿菌的菌群數(shù)分別從8.87 CFU/mL和9.15 CFU/mL降低到7.82 CFU/mL和8.09 CFU/mL。延長消化時(shí)間，兩種菌菌落數(shù)量變化不顯著（p＞0.05），說明兩種乳酸菌可在腸道內(nèi)很好的存活。

2.1.3 膽鹽濃度的影響

膽汁中含有大量膽鹽，通常膽鹽會影響乳酸菌耐受性[25,26]。本研究也發(fā)現(xiàn)，膽鹽添加量與毛酸漿果汁中乳酸菌菌落數(shù)呈負(fù)相關(guān)（如圖1c）。兩種乳酸菌能夠耐受一定濃度的膽鹽。膽鹽濃度為4 g/L時(shí)，消化24 h，果汁中發(fā)酵乳桿菌及植物乳桿菌菌落數(shù)分別為7.06 CFU/mL和7.62 CFU/mL。

2.1.4 胃腸消化過程的影響

毛酸漿發(fā)酵果汁經(jīng)體外模擬胃腸體系消化后，發(fā)酵乳桿菌數(shù)量由胃液體系到腸液體系顯著降低（p＜0.05），但與腸液消化時(shí)間長短無關(guān)（p>0.05）；但植物乳桿菌菌落總數(shù)由胃消化結(jié)束（7.76 CFU/mL）至10 h后腸液消化結(jié)束（7.54 CFU/mL），有顯著性變化（p＜0.05），腸液消化4 h～8 h時(shí)菌落總數(shù)變化不顯著。對比蔡靜靜等[27]關(guān)于乳制品中的七種乳酸菌的耐受性研究結(jié)果，本文選用的植物乳桿菌及發(fā)酵乳桿菌耐受性更強(qiáng)?？傮w來說，兩種乳酸菌在消化10 h后仍可較好適應(yīng)胃腸道環(huán)境，利于其在腸道內(nèi)定植，從而調(diào)節(jié)腸道菌群環(huán)境[28]。

2.2 體外模擬消化過程中發(fā)酵毛酸漿果汁多酚變化規(guī)律

如圖2a所示，胃液pH值對毛酸漿果汁中多酚釋放量影響顯著（p＜0.05）。pH值在1.5～4間，多酚含量從0.33 mg/mL提高至至0.53 mg/mL，因此，胃液酸度降低利于多酚的釋放。多酚是具有多種生理活性的植物化學(xué)物質(zhì)[29,30]。本文的研究結(jié)果顯示，在pH值1.5～4之間的胃液環(huán)境下，毛酸漿多酚較消化前顯著提高。這可能是由于酸性條件下，多酚類物質(zhì)發(fā)生水解導(dǎo)致某些苷類化合物轉(zhuǎn)化成苷元，增加多酚的含量[31]。胃液中的胃蛋白酶一方面可以水解發(fā)酵果汁中的多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的化學(xué)鍵，如共價(jià)鍵與氫鍵等，多酚由結(jié)合態(tài)變?yōu)橛坞x態(tài)，另一方面，胃蛋白酶還會減弱細(xì)胞壁與酚酸之間相互作用的酯鍵，從而利于酚酸類化合物的釋放[32]。

圖2 毛酸漿發(fā)酵果汁模擬胃液、腸液、膽鹽液及胃腸消化過程中多酚的變化Fig.2 The polypheol of ferment Physalis pubescens L. juice in artificial gastric juice, artificial intestinal juice, artificial bile salt and simulated gastrointestinal digestion

如圖2b所示，發(fā)酵毛酸漿果汁中的多酚釋放量隨腸液消化時(shí)間的延長而顯著增加（p＜0.05）。在模擬胃腸消化過程中（圖2c），果汁在進(jìn)入胃腸消化體系4 h內(nèi)，其多酚釋放最為明顯（p＜0.05），此后變化不顯著。與腸液消化階段相比，胃液是果汁釋放多酚的主要階段。消化前后相比，兩種毛酸漿乳酸菌發(fā)酵果汁中多酚含量菌可提高1.45倍及1.29倍，菌種間變化無差異性。酚類化合物主要以酯類、糖苷類和化合物的形式存在于食物中，不能以天然形式吸收[32]。只有多酚類化合物分解形成高度親脂性的苷元才可以通過生物膜然后被吸收[33]。而當(dāng)結(jié)合酚的釋放達(dá)到平衡時(shí)，多酚含量平衡，不再發(fā)生顯著性變化。這與饒雪甜等[34]人的研究結(jié)論相一致。

2.3 體外模擬消化過程中發(fā)酵毛酸漿果汁抗氧化性變化規(guī)律

圖3 顯示了毛酸漿發(fā)酵果汁DPPH自由基清除力、ABTS+·、FRAP等抗氧化指標(biāo)變化情況。在模擬胃體外消化階段，毛酸漿發(fā)酵果汁的DPPH·、ABTS+·清除力和總還原力（FRAP）顯著上升（p＜0.05）。植物乳桿菌分別上升了4.92%、23.80%及41.32%，發(fā)酵乳桿菌分別上升了4.98%、15.55%及17.72%。模擬腸體外消化2 h內(nèi)，植物乳桿菌發(fā)酵果汁的三種抗氧化指標(biāo)均顯著降低1.89%、14.67%及13.08%（p＜0.05），發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵果汁的三種抗氧化指標(biāo)則分別降低了0.02%、19.71%及5.55%。此后果汁的兩個(gè)自由基清除力指標(biāo)變化不明顯，但還原力仍分別下降了35.50%和27.1%（p＜0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)，在模擬胃液消化階段，抗氧化與酚類的增加呈顯著正相關(guān)。而在腸消化階段，雖然毛酸漿果汁中酚類物質(zhì)增加，但抗氧化性降低。這也許是由于，從胃液到腸液，pH值從酸性提升到中性，一些化合物因敏感提供而引起的結(jié)構(gòu)重組，或者與食物成分結(jié)合形成新的復(fù)合物，從而導(dǎo)致果汁抗氧化能力和還原力的降低[35]。

圖3 毛酸漿發(fā)酵果汁模擬胃腸消化過程中抗氧化性的變化Fig.3 The antioxidant properties of ferment Physalis pubescens L. juice in simulated gastrointestinal digestion

3 結(jié)論

本研究模擬體外胃腸道消化系統(tǒng)，對發(fā)酵毛酸漿果汁中的乳酸菌耐受性進(jìn)行了評價(jià)，分析了消化后毛酸漿果汁的活性成分及抗氧化性的變化情況。研究中發(fā)現(xiàn)，毛酸漿乳酸菌發(fā)酵果汁經(jīng)體外胃腸道消化后，植物乳桿菌及發(fā)酵乳桿菌菌群數(shù)量依舊可以保持在7.54 CFU/mL和7.82 CFU/mL。經(jīng)模擬胃液、腸液消化后，毛酸漿發(fā)酵果汁多酚含量由0.33±0.01 mg/mL及0.40±0.03 mg/mL提高了45.15%及29.20%；胃液消化后，抗氧化活性和還原力均有不同程度的提高，菌群環(huán)境耐受性強(qiáng)。該結(jié)論對乳酸菌發(fā)酵植物原料的功效性研究提供了參考。