馬兜鈴酸和缺血再灌注所致急性腎損傷后慢性腎臟病小鼠模型的比較*

譚 微，鄧軍輝，吳志芬，鄭盧權(quán)，楊聚榮

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腎內(nèi)科 401120)

急性腎損傷(AKI)是一個全球性的公共健康問題，每年約1 330萬人受累，死亡170萬人[1]。幸存者中僅少部分患者可完全恢復(fù)，部分直接進展為慢性腎臟病(CKD)，甚至終末期腎病(ESRD)。據(jù)報道，需透析支持的AKI患者大部分都直接進展為CKD[2]，總體來說約20%的AKI患者在3年后會發(fā)展為CKD[3-4]，AKI是CKD的獨立危險因素[5]。但是AKI過渡為CKD的確切機制尚不完全清楚，亦無有效治療手段。揭示AKI-CKD的重要機制，將為其治療提供新的靶點，有望改善遠期預(yù)后。動物模型是研究機制和開發(fā)潛在治療靶點的工具，目前用于研究AKI后CKD的動物模型最常見的為缺血再灌注損傷(IRI)、腎毒性藥物損傷，盡管臨床上馬兜鈴酸損傷(AAI)的發(fā)病率不高，但HONARPISHEH等[6]的研究認為馬兜鈴酸優(yōu)于順鉑和葉酸，因此，選擇馬兜鈴酸為藥物損傷代表。本研究比較馬兜鈴酸及缺血再灌注所致AKI-CKD模型的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

本實驗采用SPF級雄性BALB/c小鼠，8周齡，體重20～23 g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，環(huán)境溫度為(25±2)℃，濕度為50%～70%，12 h光照陰暗交替。

1.1.2實驗試劑

Schiff染液、蘇木素染液購自中杉金橋生物有限公司。Regaud蘇木精：蘇木精1 g，95%乙醇10 mL，甘油10 mL，蒸餾水80 mL。Masson麗春紅酸性復(fù)紅液：麗春紅0.7 g，酸性復(fù)紅0.3 g，蒸餾水99 mL，冰醋酸1 mL。1%冰醋酸水溶液：冰醋酸0.2 mL，蒸餾水100 mL。1%磷鉬酸水溶液：磷鉬酸1 g，蒸餾水100 mL。1%苯胺藍水溶液：苯胺藍2 g，蒸餾水98 mL，冰醋酸2 mL。1%光綠水溶液：光綠1 g，蒸餾水100 mL。

1.2 方法

1.2.1AAI模型

雄性BALB/c小鼠60只，分為假手術(shù)組和AAI組，每組30只。馬兜鈴酸5 mg以生理鹽水稀釋為1 mg/mL，AAI組以5 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射，對照組注射等量生理鹽水。兩組均于給藥后第1、3、7、14、28、42天處死動物，AAI組分別以AAI組-1 d、AAI組-3 d、AAI組-7 d、AAI組-14 d、AAI組-28 d、AAI組-42 d命名，腹腔注射水合氯醛麻醉，經(jīng)小鼠眼眶采血，并打開胸腔行心臟灌注后，取雙側(cè)腎組織標(biāo)本，去除腎臟包膜，部分腎臟固定于4%多聚甲醛，用于腎臟病理組織染色。

1.2.2IRI模型

雄性BALB/c小鼠60只，分為假手術(shù)組和IRI組，每組30只。小鼠予以腹腔注射5%水合氯醛溶液0.1 mL/10 g劑量麻醉，IRI組做背部兩側(cè)切口，游離雙側(cè)腎蒂，使用血管夾夾閉雙側(cè)腎蒂，觀察腎臟顏色變黑后計時，小鼠置于37 ℃恒溫臺保持溫度，傷口用生理鹽水紗布覆蓋，32 min后移去血管夾，確認腎臟顏色變鮮紅后，縫合兩側(cè)切口；假手術(shù)組小鼠做背部兩側(cè)切口，游離雙側(cè)腎蒂后縫合切口。術(shù)后分別于再灌注后第1、3、7、14、28、42天處死動物，IRI組分別以IRI組-1 d、IRI組-3 d、IRI組-7 d、IRI組-14 d、IRI組-28 d、IRI組-42 d命名，再次腹腔注射水合氯醛麻醉，經(jīng)小鼠眼眶采血，并打開胸腔行心臟灌注后，取雙側(cè)腎組織標(biāo)本，去除腎臟包膜，部分腎臟固定于4%多聚甲醛，用于腎臟病理組織染色。

1.2.3腎功能檢測

采集的血液于離心機離心(3 000 r/min，10 min)后取上清液，采用自動分析儀(德國Beckman 5800)檢測小鼠血清肌酐、尿素氮水平。

1.2.4腎組織PAS染色

腎組織用4%多聚甲醛固定過夜，沖洗、脫水、石蠟包埋后切片，行PAS染色觀察腎臟病理損傷程度。將切片浸入高碘酸氧化液中10～20 min，蒸餾水洗2次；Schiff液染色10～30 min，流水沖洗5 min；蘇木素染細胞核3～5 min，在鹽酸乙醇中分化，自來水洗至細胞核變藍；然后脫水、透明、封固。雙盲情況下由2名腎臟病理醫(yī)師在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察并評分，每個標(biāo)本至少隨機觀察10個不重復(fù)視野。腎小管損傷的嚴(yán)重程度由組織學(xué)評分系統(tǒng)量化：0分代表沒有損傷；1分(0%～10%)和2分(>10%～20%)為輕度損傷；3分(>20%～40%)、4分(>40%～60%)為中度損傷；5分(>60%～75%)、6分(>75%)為重度損傷。

1.2.5腎組織Masson染色

腎組織用4%多聚甲醛固定過夜，沖洗、脫水、石蠟包埋后切片，行Masson染色。石蠟切片脫蠟至水，依次自來水和蒸餾水洗，Regaud蘇木精染液染核5～10 min，充分水洗，溫水返藍，Masson麗春紅酸性復(fù)紅液5～10 min，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，1%苯胺藍或光綠液染5 min，1%冰醋酸水溶液分化30 s，95%乙醇、無水乙醇、二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 造模后小鼠死亡率

對照組均無小鼠死亡。AAI組腹腔注射馬兜鈴酸后，第7天死亡2只，死亡率6.7%。IRI組術(shù)后第1天死亡4只，第2天死亡2只，共死亡6只，死亡率20.0%。兩組比較IRI組死亡率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 小鼠體重變化情況

兩對照組小鼠體重隨時間逐漸增加。IRI組和AAI組小鼠出現(xiàn)不同程度體重下降，AAI組小鼠體重下降更顯著(P<0.05)。IRI組小鼠體重輕度下降，術(shù)后第7天恢復(fù)，AAI組小鼠體重給藥后第7天最輕，后逐漸恢復(fù)，至第42天AAI組和IRI組體重均低于各自對照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 小鼠造模后體重變化

2.3 小鼠血清尿素、肌酐水平

造模后IRI組和AAI組小鼠均出現(xiàn)不同程度血肌酐、尿素升高，但達峰時間存在差異，IRI組術(shù)后第1天最高，AAI組術(shù)后第7天最高，至造模后42 d均高于各自對照組。兩組間峰值亦存在差異，IRI組的峰值血肌酐、尿素高于AAI組(P<0.05，圖2)。

圖2 小鼠血清尿素、肌酐水平

2.4 小鼠腎臟纖維化情況

Masson三色染色后腎組織中的膠原纖維呈藍色，是檢測器官纖維化的常用染色方法之一。兩個對照組腎小管-間質(zhì)幾乎未見陽性的膠原組織(圖3A)，造模后第7天IRI和AAI組仍無明顯藍色膠原纖維，14 d開始至42 d腎臟組織中可見藍色染色陽性(圖3B、3C)，AAI組陽性面積多于IRI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3D)，并伴有腎小管萎縮、間質(zhì)炎性細胞浸潤。

A：AAI對照組-42 d、IRI對照組-42 d Masson染色(×400)；B:AAI組不同時間點小鼠腎組織Masson染色(×400)；C:IRI組不同時間小鼠腎組織Masson染色(×400)；D：AAI組、IRI組不同時間點Masson陽性表達面積。

2.5 腎組織PAS染色及腎小管損傷評分

兩個對照組小鼠腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常。腎小管細胞上皮細胞連接緊密、形態(tài)規(guī)則、排列整齊、邊緣完整，細胞間隙未見水腫和炎癥浸潤(圖4A)。AAI和IRI組損傷后表現(xiàn)為不同程度的腎小管上皮細胞大量壞死、脫落，基底膜裸露，管腔內(nèi)管型形成，腎間質(zhì)水腫，并伴有炎性細胞浸潤等病理表現(xiàn)(圖4C、D)。IRI組以第1天損傷最重。AAI組以第7天組織損傷最重，可見大量管型，至第42天部分腎小管仍無完整結(jié)構(gòu)。腎小管-間質(zhì)損傷評分結(jié)果顯示，IRI組第1天高于AAI組，而AAI組第7天明顯高于IRI組(P<0.05，圖4B)。

A：AAI對照組-7 d、IRI對照組-1 d PAS染色(×400)；B：AAI組、IRI組小鼠不同時間點腎小管損傷評分；C：AAI組不同時間點小鼠腎組織PAS染色(×400)；D：IRI組不同時間點小鼠腎組織PAS染色(×400)。

3 討 論

AKI的發(fā)病率和病死率均較高，其嚴(yán)重程度及頻率決定了CKD的進展[7]。輕度損傷時腎臟可完全恢復(fù)，損傷較重或反復(fù)損傷后可能導(dǎo)致不恰當(dāng)修復(fù)，最終發(fā)生不可逆的纖維化，進展為CKD。尋找穩(wěn)定且可再現(xiàn)的AKI-CKD模型對于揭示其病理生理機制至關(guān)重要。

盡管當(dāng)前認為IRI模型缺乏穩(wěn)定性，但因其較好的臨床相關(guān)性，被作為經(jīng)典模型廣泛應(yīng)用。IRI是臨床AKI的主要原因，特別是雙側(cè)IRI模型可較好模擬人體內(nèi)AKI的病理生理過程，因為人體內(nèi)的缺血再灌注以雙側(cè)腎臟為主。已報道的IRI模型用于研究AKI-CKD進程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激、補體的激活、巨噬細胞的浸潤等[8-10]，以及抗凝血酶Ⅲ減輕AKI后CKD的進展[11]。但IRI模型對實驗者操作技術(shù)要求更高，且因其創(chuàng)傷更大，術(shù)后死亡率更高，還存在造模不穩(wěn)定、模型參數(shù)變化大等瓶頸。報道的缺血時間為30、32、35 min不等[12-14]，本研究采用中間時間32 min，通常情況小鼠腎臟缺血時間越長，急性期腎損傷程度越重，后期更易進展為CKD，但這也意味著更高的死亡率。缺血過程中夾閉雙側(cè)腎動脈的動脈夾亦至關(guān)重要，若血流阻斷不完全，即使相同的缺血時間，腎臟受損的程度亦不一致。此外，缺血過程中小鼠的體溫也影響IRI后的轉(zhuǎn)歸，相同的缺血時間，體溫相差0.5 ℃也可能導(dǎo)致完全不同的轉(zhuǎn)歸，偏低的體溫更有利于實驗動物耐受IRI[15-16]。因此，造模過程中腎動脈血流完全阻斷、嚴(yán)格穩(wěn)定的溫度控制、嫻熟的手術(shù)技巧，均是保證IRI模型穩(wěn)定和可靠的關(guān)鍵因素。

既往研究認為，AAI模型可能會導(dǎo)致急性期近端小管細胞損傷和壞死、氧化應(yīng)激，以及慢性期進行性間質(zhì)性腎纖維化[12,17]，給藥方法包括一次性腹腔注射或連續(xù)注射。馬兜鈴酸腎病的臨床病理特點表現(xiàn)為近端小管上皮細胞萎縮伴間質(zhì)纖維化。而小鼠給予馬兜鈴酸腹腔給藥后，急性期表現(xiàn)為急性腎小管損傷，后期出現(xiàn)細胞外基質(zhì)沉積，并伴炎性反應(yīng)，與本研究的結(jié)果一致。當(dāng)然，不同的小鼠品系在造模過程中可能表現(xiàn)并不完全一致，這需要在實驗過程中進一步摸索條件，而其他的諸如麻醉劑量、小鼠年齡、性別和喂養(yǎng)條件等均可以得到較好地控制。

本研究中AAI和IRI均可成功誘導(dǎo)AKI-CKD模型，急性期小鼠腎功能部分丟失，腎小管上皮細胞壞死、脫落、管型形成，慢性期小管萎縮、間質(zhì)纖維沉積。與AAI組比較，IRI組死亡率更高，腎臟損傷出現(xiàn)更早，纖維化程度較輕。綜合評估AAI模型簡單、穩(wěn)定，組織學(xué)特征與臨床病理改變相似，且動物存活率更高，更能完整全面地評估腎臟的遠期預(yù)后，是研究AKI-CKD的較好模型。但AKI-CKD的不同模型在機制上是否存在差異，尚有待后續(xù)的深入研究，如果實驗設(shè)計是證實AKI-CKD 轉(zhuǎn)歸的共性機制，可以納入兩種以上的動物模型。