頭針聯(lián)合中藥對缺血性腦卒中后認知障礙大鼠P38MAPK作用研究

張 野，叢德毓，張紅石，胡冠宇，汲廣成，王宇峰*

（1.長春中醫(yī)藥大學，長春 130117；2.吉林省中醫(yī)院，長春 130021；3.長春中醫(yī)藥大學附屬第三臨床醫(yī)院，長春 130117）

缺血性腦卒中是引起認知障礙的主要因素，絕大多數(shù)缺血性腦卒中患者都會伴有認知障礙，嚴重者會有抑郁傾向。目前認為認知障礙病變的關鍵部位在尾狀核、丘腦、內(nèi)囊膝部、角回和額頂葉等，且在左半球損傷的認知障礙較右側(cè)重。流行病學和臨床病理研究發(fā)現(xiàn)，認知障礙與腦血管病變密切相關。大鼠P38絲裂源活化蛋白激酶（P38MAPK）磷酸化后可被激活，參與炎癥、應激反應、細胞凋亡等，是機體眾多細胞轉(zhuǎn)導通路的中轉(zhuǎn)站，是各類炎癥反應的重要激酶，一般認為激活升高，促進腫瘤細胞凋亡，但是對腦損傷需要進一步研究。研究[1]表明P38MAPK 在阿爾茨海默病血液與疾病持續(xù)時間呈正相關，也就是認知障礙患者中P28MAPK 表達增加，且在大腦與學習和記憶相關區(qū)域中高度表達[2]。在各種認知障礙動物模型中也進證實了p38MAPK 參與 Aβ 誘導的神經(jīng)元損傷的證據(jù)表明，p38MAPK 活性在認知障礙的病理展中起重要作用，抑制認知神經(jīng)元細胞中 p38MAPK 的激活是認知障礙的治療途徑之一。

1 材料與方法

1.1 材料 從長春市億斯實驗動物技術有限公司購買SD 大鼠30 只，體質(zhì)量（220～230）g，進入長春中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，隨機分為3 組，每組10只，其中2 組進行腦卒中造模，隨機選擇1 組作為頭針聯(lián)合中藥組進行頭針和中藥治療，另1 組作為模型組不予治療，未造模1 組作為空白組作為健康對照，飼養(yǎng)間保持溫度光照和濕度為23℃、12/12 光照周期（55±10）%，并自由飲水。實驗過程符合實驗動物倫理要求，已經(jīng)通過長春中醫(yī)藥大學倫理委員會審批（20190151）。

1.2 缺血性腦卒中大鼠模型建立 采用改良的大腦中動脈栓塞在灌注（MCAO）造模法，術前24 h大鼠禁食不禁水，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35 g/kg），確保大鼠手術全程無痛，以仰臥固定后常規(guī)消毒。在頸部正中切一口，用止血鉗鈍性分離組織，找到左側(cè)頸總動脈，分離左側(cè)頸內(nèi)動脈和頸外動脈，掛線備用，結(jié)扎頸外動脈。再結(jié)扎頸總動脈，夾閉頸內(nèi)動脈。在頸總動脈上距離分叉2 mm 處剪一斜口，穿入線栓，輕提頸內(nèi)動脈縫合線并松開頸內(nèi)動脈血管夾，沿頸內(nèi)動脈將線栓穿過顱骨直至手下有明顯阻力時（18 mm），實現(xiàn)大腦中動脈阻塞，導致腦缺血。結(jié)扎切口并固定線栓，剪斷多余部分縫合線，縫合傷口，予大鼠注射青霉素20 萬單位，防止感染，完成造模。造模后進行神經(jīng)功能評分。

1.3 干預方法 頭針聯(lián)合中藥治療，在造模成功后，首先中藥灌胃，按照成人1/30 的比例用量，以赤芍20 g，川芎20 g，蒲黃20 g，葛根20 g，槐花20 g，地龍20 g，紅花12 g，豨薟草30 g，三七18 g，加適量水熬2 h，剩余藥液300 mL。給藥時每只大鼠灌胃5 mL。頭針治療在灌胃后進行，取腦部的頂區(qū)及頂前區(qū)，以0.5 寸針向前方刺入，采取叢刺法和長留針方式，以醫(yī)用膠布塊固定，放入無墊料籠中，配合帶針運動，留針6～8 h，每日1 次，每周針刺5 次，持續(xù)4 周。

1.4 血清和腦組織中p38MAPK 濃度測定 治療周期結(jié)束后，分別將空白組、模型組、聯(lián)合組的大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35 g/kg），確保大鼠肌肉放松并且無痛，剪開腹腔，腹主動脈取血5 mL，并將血液樣本離心（2 000×g，4℃、15 min），離心后獲得上層血清。大鼠處于麻醉狀態(tài)，取血后斷頭處死，立即剝離腦組織，腦樣本按質(zhì)量體積比1 g:9 mL 加入9 倍體積的磷酸鹽緩沖液（PH 7.4），手工或勻漿器將標本充分勻漿并離心（2 000×g，4℃、15 min），收集上清液體備用。采用ELISA 法檢測大鼠血清p38MAPK（南京建成生物工程研究所；大鼠96T），嚴格按照試劑盒說明書步驟進行實驗。

1.5 大鼠行為學檢測 Morris 水迷宮試驗，用于測試大鼠的復雜記憶和空間定位能力。水迷宮（ZS-001moriss）由一個圓柱形水槽和圖像采集分析系統(tǒng)構(gòu)成（DIGITAL CCD CAMERA），四周圍有遮光布，減少外界干擾，利用動物求生本能，尋找隱藏水中的平臺，記錄每只大鼠所需要的時間和路線。

1.6 觀察指標 觀察各組大鼠血清及腦組織中p38MAPK 的濃度和大鼠行為學檢測的水迷宮測試、懸吊試驗，并且結(jié)合大鼠行為學改變與大鼠血清和腦組織內(nèi)p38MAPK 的濃度變化分析頭針聯(lián)合中藥的作用機制。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，治療前后對比采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 建模結(jié)果 建模后未出現(xiàn)大鼠腹膜炎跡象，具有正常生命體征，觀察10 只空白對照大鼠和20 只造模大鼠（模型組和聯(lián)合組）在造模前后的行為學變化，水迷宮測試結(jié)果顯示造模前3 組無統(tǒng)計學差異，造模后2 組與空白組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），提示造模成功，見表1。

表1 各組造模前后水迷宮測試時間比較（，n =10）s

表1 各組造模前后水迷宮測試時間比較（，n =10）s

注：與空白組比較，# P ＜0.05

2.2 P38MAPK 濃度結(jié)果 大鼠血清中P38MAPK 濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，具有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；聯(lián)合組與模型組比較，具有顯著性統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。大鼠腦組織中P38MAPK濃度結(jié)果顯示，空白組與模型組比較，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），聯(lián)合組與模型組比較，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表2。

表2 各組血清與腦組織內(nèi)P38MAPK 比較（，n =10）（nmol/L）

表2 各組血清與腦組織內(nèi)P38MAPK 比較（，n =10）（nmol/L）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.3 治療1 周后大鼠行為學功能結(jié)果 觀察3 組大鼠在治療前后的行為學變化。水迷宮測試結(jié)果顯示，聯(lián)合組在治療前后比較，尋找平臺時間減少，具有顯著性差異（P＜0.01），治療后模型組分別和空白組、聯(lián)合組比較，均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表3。治療后模型組、空白組、聯(lián)合組大鼠行為學路線比較，見圖1。

表3 各組治療前后水迷宮測試時間比較（，n =10） s

表3 各組治療前后水迷宮測試時間比較（，n =10） s

注：與其他2 組比較，# P ＜0.05

圖1 大鼠治療前后水迷宮測試路線比較

3 討論

缺血性腦卒后的認知障礙屬于中醫(yī)理論中的“呆病”范疇，是腦動脈梗死引起的腦組織缺血和缺氧而導致。針刺和中藥臨床聯(lián)用療效顯著，研究[3]表明針灸和中藥可以抗血栓、保護血管，能夠?qū)τ谘軆?nèi)皮組織細胞產(chǎn)生影響，從而促進血管內(nèi)皮再生和重塑，增加側(cè)支循環(huán)，結(jié)合長白山通經(jīng)調(diào)臟手法流派學術實踐，采用頭針聯(lián)合中藥的治療方案進行治療，一方面通過對督脈的疏通，調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)功能，尤其注重觀察神智方面癥狀的改善；另一方面活血化瘀的藥物，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞，促進血管再生，達到“治神調(diào)形”的效果，臨床應用較廣，療效確切，但是多停留于理論方面和臨床觀察研究，在作用機理方面仍然缺乏足夠認識。

頭針聯(lián)合中藥治療方案是基于活血通經(jīng)的傳統(tǒng)治療原則和腦缺血后的血管再生保護機制而確立。血管再生（angiogenesis）是通過血管內(nèi)皮細胞的分化增殖、轉(zhuǎn)運、重組、分裂、分支而形成新的血管網(wǎng)絡，從而改善局部血液循環(huán)和血氧供應，與中醫(yī)的活血通經(jīng)理論具有一致性，在既往的臨床治療中顯示具有良好療效，但是缺少理論機制的研究。腦卒中是由于大腦動脈突然閉塞而導致的腦血流減少，腦組織由于循環(huán)不足、缺少氧氣以及能量不足而導致神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞等功能損害，致使認知障礙等一系列病變。所以基于《靈樞經(jīng)》“頭有氣街”理論，并結(jié)合缺血性腦卒中與頭氣街的聯(lián)系，應用頭針方法進行治療。治療腦卒中主要選取頂區(qū)和頂前區(qū)以及額區(qū)，并以頭部的重要經(jīng)脈督脈作為縱向維度基準，既符合頭針分區(qū)理論又兼顧通督調(diào)神理念。本研究選取活血化瘀的赤芍、紅花、地龍、蒲黃、三七和通經(jīng)絡的川芎、葛根、槐花、豨薟草進行組方，依據(jù)臨床實踐中對于卒中后認知障礙治療，進行對腦卒中后認知障礙大鼠模型治療的實驗，并結(jié)合p38MAPK 探索其作用機制。

P38MAPK是能夠感受不同的生物學刺激的物質(zhì)之一，參與許多信號傳到通路，在中樞系統(tǒng)中P38MAPK與學習和記憶功能相關[4]，在學習記憶區(qū)域高度表達，可能是相關腦功能的關鍵信號[5]。實驗結(jié)果表明，造模后模型組的血清內(nèi)檢測P38MAPK 濃度高于空白組（P＜0.01）。造模后模型組的腦組織內(nèi)P38MAPK濃度高于空白組（P＜0.05），說明腦卒中后認知障礙大鼠模型的血液及腦組織中P38MAPK 濃度均受到影響，這與研究[6]關于P38MAPK 參與Aβ 誘導神經(jīng)元損傷的研究一致。楊申[7]予血管性癡呆大鼠模型P38MAPK 抑制劑SB202190，結(jié)果證明P38MAPK 是導致認知障礙發(fā)生的物質(zhì)之一，且相關通路具有促進神經(jīng)元生長作用。研究[8]發(fā)現(xiàn)P38MAPK 可以激活下游Caspase-3，能夠啟動細胞的凋亡，造成神經(jīng)細胞損傷，治療后聯(lián)合組血清內(nèi)P38MAPK 濃度低于模型組（P＜0.01），聯(lián)合組腦組織內(nèi)P38MAPK 濃度低于模型組（P＜0.05），說明頭針聯(lián)合中藥的方案能夠通過干預P38MAPK 修復卒中后大鼠認知障礙功能。P38MAPK 可以激活下游Caspase-3，能夠啟動細胞的凋亡，造成神經(jīng)細胞損傷。治療后聯(lián)合組血清內(nèi)P38MAPK濃度低于模型組，有顯著性差異（P＜0.01），聯(lián)合組腦組織內(nèi)P38MAPK 濃度低于模型組，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），說明頭針聯(lián)合中藥的方案能夠通過干預P38MAPK 從而修復卒中后大鼠認知障礙功能。

綜上所述，本研究表明大鼠腦組織和血清內(nèi)P38MAPK 濃度升高與大鼠缺血性腦卒中的認知障礙發(fā)生相關，大鼠血清和腦組織內(nèi)P38MAPK 參與卒中大鼠認知恢復過程，頭針聯(lián)合中藥的治療方案可以促進卒中后認知障礙大鼠模型血清及腦組織內(nèi)P38MAPK的濃度降低，能夠促進修復受損傷大鼠模型的空間記憶能力。