升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠骨骼肌線粒體動(dòng)力學(xué)的影響研究

李玲玲，蘇 磊，胡夢圓，張昕雨，魯 藝

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

慢性疲勞綜合征是一種涉及全身臟器，影響人們生活質(zhì)量的復(fù)雜疾病，本病發(fā)生多與慢性應(yīng)激相關(guān)[1-2]。近年來，慢性疲勞綜合征的發(fā)病率越來越高[3]，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為主要涉及能量代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、遺傳因素等，線粒體動(dòng)力學(xué)對細(xì)胞能量代謝具有重要的意義[4-5]。西醫(yī)對此尚無令人滿意的治療方法，中醫(yī)治療此病的優(yōu)勢日益顯現(xiàn)。中醫(yī)學(xué)將慢性疲勞綜合征歸屬于“虛勞”“郁證”范疇[6]。臨床研究[7]結(jié)果表明，升陽散火湯可以顯著改善CFS患者的癥狀和抑郁狀態(tài)，但升陽散火湯治療慢性疲勞綜合征的機(jī)制尚不明確。其具體機(jī)制和拆方后的各個(gè)組合的抗疲勞作用尚值得進(jìn)一步探討。本研究采用冰水游泳、慢性束縛、夾尾復(fù)合方法構(gòu)建慢性疲勞小鼠模型，從線粒體動(dòng)力學(xué)的角度，探討升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠行為學(xué)及骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響，以期明確慢性疲勞小鼠的線粒體損傷情況及升陽散火湯及其拆方的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性ICR 小鼠50 只，體質(zhì)量（20±2）g，SPF 級(jí)，5～6 周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）2016-0006。完全按照動(dòng)物中心飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，SPF 級(jí)環(huán)境，溫度18～25℃，自由攝食和飲水，定期觀察小鼠生長狀況，及時(shí)更換墊料并定時(shí)給藥。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。動(dòng)物倫理號(hào)：BUCM -4 -2021030301-1017

1.2 藥物制備 升陽散火湯所含藥味生甘草（批號(hào)20022551）每袋24 g，相當(dāng)于飲片120 g；防風(fēng)（批號(hào)20008401）每袋12 g，相當(dāng)于飲片120 g；升麻（批號(hào)20007371）每袋16 g，相當(dāng)于飲片160 g；葛根（批號(hào)19029601）每袋16 g，相當(dāng)于飲片160 g；獨(dú)活（批號(hào)20009871）每袋32 g，相當(dāng)于飲片160 g；白芍藥（批號(hào)20020801）每袋8 g，相當(dāng)于飲片160 g；羌活（批號(hào)20005711）每袋16，g 相當(dāng)于飲片160 g；人參（批號(hào)20008481）每袋32 g，相當(dāng)于飲片160 g；柴胡（批號(hào)20022891）每袋20 g，相當(dāng)于飲片200 g；炙甘草（批號(hào)20018851）每袋24 g，相當(dāng)于飲片120 g。取相當(dāng)于飲片等量的各味藥顆粒劑，混合后，用100 ℃蒸餾水配制成升陽散火湯水溶液備用。配方顆粒均由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室進(jìn)行質(zhì)量控制檢測。

1.3 試劑及儀器

1.3.1 試劑BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：PC0020）、RIPA裂解液（貨號(hào)：R0020）、預(yù)染蛋白marker（貨號(hào)：PR1920）、PVDF膜（貨號(hào)：IPVH00010）、Super ECL Plus 升級(jí)版超敏發(fā)光液（貨號(hào)：P1010），均購于北京拜爾迪生物科技有限公司；GAPDH（貨號(hào)TA-08）、DRP1 Rabbit Antibody（貨號(hào)：YT1414）、MFN1 Rabbit Antibody（貨號(hào)YN3054）、OPA1 Rabbit Antibody（貨號(hào)：YN2976）均購于Proteintech 公司；TEMED（貨號(hào)：T8133）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號(hào)：ZB-2301）、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（貨號(hào)：134560）均購于北京百諾威生物科技有限公司。

1.3.2 儀器 MIKRO 22R 低溫冷凍離心機(jī)（德國Hettich 公司），TEM-1400plus 透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社），VE-180 電泳儀及電轉(zhuǎn)儀（上海Tanon 科技有限公司），MULTISKAN MK3 酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific 公司），610C 凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司），SKY-200B 搖床（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型制備 采用數(shù)字隨機(jī)分組法將ICR 小鼠分為5組，即空白組、模型組、升陽散火湯全方組（生甘草、防風(fēng)、升麻、葛根、獨(dú)活、白芍、羌活、人參、柴胡、炙甘草）、補(bǔ)虛組（人參、芍藥、生甘草、炙甘草），升陽散郁組（升麻、葛根、柴胡、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活），每組10 只。除空白組外，采用單日進(jìn)行束縛和力竭游泳，雙日進(jìn)行夾尾和束縛[8]復(fù)制慢性疲勞動(dòng)物模型，在整個(gè)試驗(yàn)期間保持造模。

1.4.2 給藥方法 升陽散火湯按照 《內(nèi)外傷辨惑論》原方中記載的用量為升麻、葛根、獨(dú)活、羌活、白芍藥、人參（以上各五錢），甘草（炙）、柴胡（以上各三錢），防風(fēng)（二錢五分），甘草（生，二錢）通過度量衡換算，金代一兩約為現(xiàn)代 40 g，1 兩=10 錢=100 分，據(jù)此折算為現(xiàn)代劑量進(jìn)行制備（升麻、葛根、獨(dú)活、羌活、白芍藥、人參各20 g，炙甘草、柴胡各12 g，防風(fēng)10 g，生甘草8 g），按照小鼠與人的體表面積及原藥與顆粒劑比例折算小鼠的用藥劑量，升陽散火湯組給藥劑量為 2.73 g/kg、升陽散郁組給藥劑量為 1.57 g/kg、補(bǔ)虛組給藥劑量為 1.16 g/kg，每日1 次，連續(xù)灌胃4 周。

1.4.3 行為學(xué)測試 所有小鼠在造模第15 天、30 天、45 天進(jìn)行稱質(zhì)量記錄以及力竭游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾靜止實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 超微結(jié)構(gòu)觀察 第45 天后，每組隨機(jī)各取3 只取材，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后于右側(cè)后肢分離骨骼?。枘c肌），取約1 mm×1 mm×3 mm 大小組織塊。將取下骨骼肌標(biāo)本置于3%戊二醛溶液中繼續(xù)固定48 h 后，進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片，采用透射電子顯微鏡TEM-1400 plus觀察骨骼肌的肌絲形態(tài)及線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4.5 Western blotting 分析 提取各組小鼠骨骼肌線粒體蛋白并用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，配制10%分離膠及濃縮膠，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（80 V 30 min，120 V 60 min），濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（180 mA 90 min，0.45 μm 孔徑PVDF 膜），5%脫脂牛奶封閉120 min后孵一抗4℃過夜，所用抗體為β-actin（1:30 000）、DRP1（1:500）、OPA1（1:1 000）、MFN1（1:500）。次日37 ℃孵二抗60 min，TBST 清洗3 次用ECL 化學(xué)發(fā)光液顯色并進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。所有數(shù)據(jù)先經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)，方差齊采用多組單因素方差分析（One-way ANOVO），組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis）。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠行為學(xué)的影響

2.1.1 對慢性疲勞小鼠體質(zhì)量的影響 與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量增長緩慢（P＜0.05）；給藥干預(yù)15、30 d 后與模型組比較，各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠體質(zhì)量的影響（，n =10） g

表1 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠體質(zhì)量的影響（，n =10） g

注：與正常組比較，# P ＜0.05

2.1.2 對慢性疲勞小鼠力竭游泳時(shí)間的影響 各組小鼠造模15 d后，與正常組比較，模型組、升陽散火湯組、升陽散郁組、補(bǔ)虛組各組小鼠力竭游泳時(shí)間明顯減少（P＜0.05）；給藥干預(yù)15 d 后，與模型組比較，升陽散火湯組、補(bǔ)虛組力竭游泳時(shí)間明顯升高（P＜0.05）其中以補(bǔ)虛組的效果最明顯；給藥干預(yù)30 d 后與模型組比較，升陽散火湯組、補(bǔ)虛組、升陽散郁組力竭游泳時(shí)間均顯著升高（P＜0.05）。見表2

表2 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠力竭游泳時(shí)間的影響（，n =10） min

表2 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠力竭游泳時(shí)間的影響（，n =10） min

注：與正常組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.1.3 對慢性疲勞小鼠懸尾靜止時(shí)間的影響 各組小鼠造模15 d 后，與正常組比較，模型組、升陽散火湯組、升陽散郁組、補(bǔ)虛組各組小鼠懸尾靜止時(shí)間明顯增加（P＜0.05）；給藥干預(yù)15 d 后，與模型組比較，升陽散火湯組、升陽散郁組小鼠懸尾靜止時(shí)間縮短（P＜0.05）；給藥干預(yù)30 d 后，與模型組比較，升陽散火湯組及其拆方各組小鼠懸尾靜止時(shí)間縮短（P＜0.05）。見表3。

表3 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠懸尾靜止時(shí)間的影響（，n =10）

表3 升陽散火湯及其拆方對慢性疲勞小鼠懸尾靜止時(shí)間的影響（，n =10）

注：與正常組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.2 骨骼肌超微電鏡結(jié)果 空白組小鼠骨骼肌肌絲排列整齊，線粒體形狀規(guī)則，呈橢圓形，膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)嵴清晰。模型組小鼠骨骼肌線粒體形狀不規(guī)則，膜溶解并相互連接，內(nèi)嵴溶解缺失明顯，排列紊亂。全藥組小鼠骨骼肌肌節(jié)清晰，線粒體形態(tài)接近空白組，多呈橢圓形，膜結(jié)構(gòu)較完整。升陽散郁組骨骼肌恢復(fù)程度不及升陽散火湯組，小鼠骨骼肌肌絲肌節(jié)欠清晰，明暗帶差異不明顯，線粒體多呈腫脹狀態(tài)，基質(zhì)變淺。補(bǔ)虛組肌節(jié)欠清晰，部分肌絲溶解，線粒體恢復(fù)程度優(yōu)于升陽散郁組。見圖1。

圖1 小鼠線粒體電鏡觀察結(jié)果

2.3 Western blotting 結(jié)果 結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組線粒體融合相關(guān)蛋白MFN1、OPA1，線粒體分裂相關(guān)蛋白DRP1 表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，升陽散火湯組、補(bǔ)虛組、升陽散郁組OPA1 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01），MFN 1 蛋白表達(dá)水平有上調(diào)趨勢；升陽散火湯組、升陽散郁組DRP1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），補(bǔ)虛組DRP1 蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。見圖2。

圖2 MFN1、OPA1、DRP1 蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

慢性疲勞綜合征病程較長，病性以虛為主，或因虛致實(shí)，虛實(shí)夾雜。本研究從氣虛生郁，郁而生熱，內(nèi)熱耗傷氣血的角度，選擇升陽散火湯及其拆方進(jìn)行慢性疲勞的研究。升陽散火湯出自李東垣《內(nèi)外傷辨惑論·卷中》“暑傷胃氣論”篇，是李東垣“火郁發(fā)之”之作，醫(yī)方考載“升麻、柴胡、羌活、獨(dú)活、防風(fēng)、干葛，皆辛溫上行之物也，故用之以升少陽之氣，清陽既出上竅，則濁陰自歸下竅，而食物傳化自無抑遏之患；芍藥味酸，能瀉土中之木；人參味甘，能補(bǔ)中州之氣；生甘草能瀉郁火于脾，從而炙之，則健脾胃而和中矣”，其補(bǔ)氣藥與風(fēng)藥結(jié)合，既可補(bǔ)而不滯，又可散而無傷，補(bǔ)中升陽，相須為用，被認(rèn)為是中醫(yī)治法中“升陽散火”法的代表方。根據(jù)“法依病機(jī)、拆方依法”的拆方研究思路，可將升陽散火湯方拆分為兩大方群，即一為補(bǔ)脾土，生氣血（人參、白芍藥、生甘草、炙甘草）；二為升清陽，散郁火（升麻、葛根、柴胡、羌活、防風(fēng)、獨(dú)活）。

慢性疲勞綜合征是一個(gè)漸進(jìn)過程，目前對于此疾病的動(dòng)物模型構(gòu)建缺乏統(tǒng)一的制定標(biāo)準(zhǔn)，我們在查閱大量資料后發(fā)現(xiàn)，采用復(fù)合因素建立慢性疲勞動(dòng)物模型更接近于慢性疲勞綜合征患者的臨床表現(xiàn)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)激15 d 后，模型組小鼠較空白組的體質(zhì)量及游泳時(shí)間明顯下降，懸尾靜止時(shí)間有增長趨勢，表明本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的疲勞動(dòng)物模型符合慢性疲勞綜合征的主要行為學(xué)特點(diǎn)[12]。

從建模第2 周開始，慢性疲勞綜合征小鼠體質(zhì)量明顯增長緩慢，與文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]一致，說明束縛和強(qiáng)迫游泳可能造成小鼠產(chǎn)生類似慢性疲勞綜合征患者體形消瘦的癥狀。在實(shí)驗(yàn)過程中升陽散火湯及其拆方各組小鼠體質(zhì)量結(jié)果與模型組無差異，提示升陽散火湯及其拆方并不能增加慢性疲勞患者的體質(zhì)量。力竭游泳時(shí)間被大多數(shù)研究者認(rèn)為是能夠反映出動(dòng)物體力情況和衡量機(jī)體疲勞程度的經(jīng)典指標(biāo)[16]。根據(jù)動(dòng)物研究表明，升陽散火湯全方及拆方均可延長小鼠游泳至力竭的時(shí)間，且短期內(nèi)（給藥2 周）補(bǔ)虛組效果更佳，長期（給藥4 周）的慢性疲勞升陽散火湯全方效果更佳。提示長期慢性疲勞患者當(dāng)以補(bǔ)虛與升陽散郁結(jié)合治療的中醫(yī)思路。在給藥2 周時(shí)，補(bǔ)虛組對力竭游泳的指標(biāo)改善作用優(yōu)于升陽散火湯組和升陽散郁組，進(jìn)一步提示短期慢性疲勞患者使用補(bǔ)虛法，可以起到最佳治療效果。尾懸實(shí)驗(yàn)不僅能體現(xiàn)出小鼠的體力情況，還能體現(xiàn)出小鼠的情緒狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠懸尾靜止時(shí)間長于正常小鼠，與文獻(xiàn)[13-15]報(bào)道一致。提示模型組小鼠體力下降，心理絕望感增加，升陽散火湯治療30 d 后慢性疲勞小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著減少，提示升陽散火湯治療后的小鼠體力較好，心理適應(yīng)性較強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)研究采用透射電鏡觀察疲勞對于小鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)損傷，發(fā)現(xiàn)慢性疲勞小鼠的骨骼肌及線粒體損傷嚴(yán)重，不易恢復(fù)，升陽散火湯可更好地保護(hù)骨骼肌及其線粒體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組線粒體融合相關(guān)蛋白OPA1、MFN1，線粒體分裂相關(guān)蛋白DRP1 表達(dá)量顯著下降，表明慢性疲勞可抑制小鼠骨骼肌線粒體分裂和融合，引起線粒體功能障礙。各給藥組線粒體融合、分裂相關(guān)蛋白均有不同程度的調(diào)節(jié)，表明升陽散火湯及其拆方均可調(diào)控線粒體分裂和融合，增強(qiáng)線粒體功能以滿足機(jī)體對能量的需求。

本研究結(jié)果表明，升陽散火湯及其拆方均具有提高小鼠抗疲勞能力。但從長期給藥治療的角度，單獨(dú)補(bǔ)虛或者升陽散郁抗慢性疲勞效果均較整方差，提示李東垣升陽散火的治療思想對慢性疲勞綜合征的臨床治療具有實(shí)際意義。