槲皮素通過FXR信號(hào)通路對(duì)膽汁淤積幼鼠的治療作用及其對(duì)MDR3、MRP2、OATP2表達(dá)的調(diào)控研究

呂 歆，張香軍，尚俊梅，胡新俊

（1.黃河三門峽醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 三門峽 472000；2.黃河三門峽醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河南 三門峽 472000 3.河南科技大學(xué)第一附屬消化內(nèi)科，鄭州 450000）

膽汁淤積癥是多種原因所致的膽汁分泌及排泄障礙，多見于嬰兒期[1]。目前臨床以特殊飲食、藥物及手術(shù)方式治療膽汁淤積癥，但整體療效仍有較大的提升空間[2]。研究[3]認(rèn)為，肝膽細(xì)胞膜有關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)異常、氧化應(yīng)激、炎癥損傷、肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常與膽汁淤積癥發(fā)病密切相關(guān)。研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，被子植物提取物槲皮素具有抗病毒、抗氧化應(yīng)激及抗炎等多種生物活性，可用于非酒精性脂肪性肝炎、肝癌等治療。目前關(guān)于槲皮素在膽汁淤積癥中的治療效果及相關(guān)機(jī)制的研究尚少。本研究通過建立膽汁淤積幼鼠模型，觀察槲皮素對(duì)膽汁淤積的治療作用，并探究相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級(jí)雄性SD 幼鼠49 只，日齡21 d，體質(zhì)量（80±20）g，購自華東師范大學(xué)[許可證號(hào)：SYXK（滬）2014-0006]。

1.2 主要試劑、儀器 槲皮素（湖北帝柏化工有限公司，純度＞98%，粉末狀），α-萘異硫氰酸酯（alphanaphthylisothi，ANIT）（山東摩爾化工有限公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（上海金畔生物科技有限公司），水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司），Trizol 試劑盒、Promega 試劑盒、Takara SYBR Green 熒光定量試劑盒（美國Santa Cruz 公司），BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司），兔抗鼠法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）多抗、多藥耐藥蛋白3（multidrug resistance 3，MDR3）單抗、多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance-associated protein2，MRP2）單抗、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽亞型2（organic anion transporting polypeptides 2，OATP2）多抗（美國Abcam 公司）。UniCel DxC 800 Synchron 全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司），SM2010R切片機(jī)、EG1150 分體式包埋機(jī)（德國徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司），CX23 光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，QRT-PCR）儀、PE2400電泳儀、Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型建立、分組及干預(yù) 取60 只SPF 級(jí)雄性SD 幼鼠，自由進(jìn)食及飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后隨機(jī)抽取10 只設(shè)為正常組。其余50 只建立膽汁淤積模型[7]。以芝麻油將ANIT 稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%的混合溶液，按幼鼠體質(zhì)量50 mg/kg 于造模開始當(dāng)天、第7 天、第14天、第21天灌胃（正常組同時(shí)間點(diǎn)灌胃等量芝麻油）。為保證藥物充分、均勻吸收，灌胃前后6 h 均禁食不禁水。造模第22 天，腹主動(dòng)脈取血，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（gamma-glutamyltranspeptidase，GGT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，如GGT 水平＞3 倍造模前水平，ALP 水平＞1.5 倍造模前水平，說明造模成功。將造模成功的39 只幼鼠隨機(jī)分為模型組（9 只）、槲皮素低劑量組（10 只）、槲皮素中劑量組（10 只）、槲皮素高劑量組（10 只）。末次ANIT 灌胃后12 h，槲皮素低、中高劑量組分別采用20、40、80 mg/kg 體質(zhì)量槲皮素灌胃（槲皮素溶解于0.2 mL 2% DMSO溶液），正常組與模型組均予2% DMSO 溶液灌胃，各組均按照10 mL/kg 體質(zhì)量灌胃，每日1 次，連續(xù)4 周。

1.3.2 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、ALP、GGT 水平測(cè)定 第2、3、4 周槲皮素灌胃后6 h，取2～3 mL 眼眶靜脈叢血，靜置20 min后以2 500 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），分離血清，置于-80 ℃環(huán)境中備用。采用全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑測(cè)定血清ALT、ALP、GGT 水平。

1.3.3 肝組織病理變化觀察 末次灌胃后6 h，所有幼鼠以10%水合氯醛按0.33 mL/100 g 體質(zhì)量進(jìn)行腹腔麻醉，剪開其腹腔，取肝臟右葉組織，每只幼鼠取材位置相同，采用10%中性甲醛溶液固定48 h，流水沖洗25 min 后梯度乙醇脫水，石蠟包埋后自然冷卻，采用病理切片機(jī)制作成連續(xù)切片，厚度為4 μm，HE 染色，采用顯微鏡觀察肝組織病理變化。

1.3.4 肝 組 織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定 采用QRT-PCR 法測(cè)定各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。取各組60 mg 肝右葉組織，Trizol 法提取總RNA，經(jīng)Nanodrop 系統(tǒng)測(cè)定濃度、純度，260 nm 位置OD/280 nm 位置OD ＞1.8。定量后采用Promega 試劑盒反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，電泳、酶標(biāo)儀定量，按Takara SYBR Green 熒光定量試劑盒說明書要求設(shè)定反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq II 11.5 μL，ddH2O 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板1.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)42 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為管家基因，2-△△Ct為目的基因相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。各基因引物序列，見表1。

表1 各基因引物序列

1.3.5 肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對(duì)表達(dá)量測(cè)定 采用Western blot 測(cè)定各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對(duì)表達(dá)量。取各組60 mg 肝右葉組織，研磨器充分研磨，轉(zhuǎn)移至離心管后與0.5 mL 細(xì)胞裂解液混合，冰上裂解，6 000 r/min離心20 min（離心半徑8 cm），收集沉淀，經(jīng)BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白含量，100 ℃水浴蛋白變性，取60 μg 等量上樣，恒定電壓下行5%～10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂奶粉封閉液封閉，室溫下?lián)u床孵育2 h，加入稀釋一抗（1:1 000），4 ℃過夜，TBTS 洗膜3×15 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:10 000），常溫孵育2 h，TBTS 洗膜3×15 min。電化學(xué)發(fā)光試劑暗室中顯影，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，分析灰度值，以FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較以重復(fù)測(cè)量方差分析檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料以方差分析檢驗(yàn)，兩兩樣本以SNK-q檢驗(yàn)分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 正常組幼鼠入組時(shí)毛發(fā)柔順、有光澤，活力充沛，進(jìn)食、進(jìn)水情況正常，尿色清亮，肝組織表面、腸管組織光滑紅潤；模型組幼鼠造模3周后毛發(fā)凌亂、松散、無光澤，精神不振，容易激惹，活動(dòng)減少，進(jìn)食量減少，尿色深黃或呈濃茶樣改變，對(duì)光、聲音刺激反應(yīng)減弱，肝組織失去紅潤、光滑的外表，部分見黃色結(jié)節(jié)，腸管明顯擴(kuò)張。槲皮素3 個(gè)劑量組表現(xiàn)出與模型組類似癥狀，但程度均輕于模型組。

2.2 各組槲皮素灌胃后第2、3、4 周血清ALT、ALP、GGT 水平比較 ALT、ALP、GGT 組間、時(shí)間、交互比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，第2、3、4 周槲皮素低、中、高劑量組血清ALT、ALP、GGT 水平均降低，但均高于正常組，槲皮素低劑量組高于槲皮素中、高劑量組，槲皮素中劑量組高于槲皮素高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與第2 周比較，槲皮素3 劑量組第3、4 周血清ALT、ALP、GGT 水平均降低，與第3 周比較，槲皮素3 劑量組第4 周血清ALT、ALP、GGT 水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常組、模型組血清ALT、ALP、GGT 水平隨時(shí)間延長無明顯變化（P＞0.05）。見表2，表3，表4。

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)血清ALT 水平比較（） （U/L）

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)血清ALT 水平比較（） （U/L）

注：與正常組比較，## P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05；與槲皮素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與槲皮素中劑量組比較，□P ＜0.05

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)血清ALP 水平比較（） （U/L）

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)血清ALP 水平比較（） （U/L）

注：與正常組比較，## P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05；與槲皮素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與槲皮素中劑量組比較，□P ＜0.05

表4 各組各時(shí)間點(diǎn)血清GGT 水平比較（ ） （U/L）

表4 各組各時(shí)間點(diǎn)血清GGT 水平比較（ ） （U/L）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05；與槲皮素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與槲皮素中劑量組比較，□P ＜0.05

2.3 各組肝組織病理變化觀察 正常組肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝小葉、匯管區(qū)無明顯異常；模型組肝細(xì)胞發(fā)生彌漫脂肪變性及碎片狀壞死，小膽管及匯管區(qū)纖維組織增生，且發(fā)現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤；槲皮素3 個(gè)劑量組肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性數(shù)量減少，小膽管及匯管區(qū)纖維組織增生減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，其中槲皮素高劑量組減輕最為明顯。見圖1。

圖1 各組肝組織病理變化（HE 染色，×200）

2.4 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素低、中、高劑量組FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均升高，但均低于正常組，槲皮素低劑量組低于槲皮素中、高劑量組，槲皮素中劑量組低于槲皮素高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。2.5 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素低、中、高劑量組FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，但均低于正常組，槲皮素低劑量組低于槲皮素中、高劑量組，槲皮素中劑量組低于槲皮素高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6、圖2。

表5 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（）

表5 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.001；與模型組比較，△△P ＜0.001；與槲皮素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與槲皮素中劑量組比較，□P ＜0.05

表6 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對(duì)表達(dá)量（）

表6 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相對(duì)表達(dá)量（）

注：與正常組比較，## P ＜0.001；與模型組比較，△△P ＜0.001；與槲皮素低劑量組比較，▲P ＜0.05；與槲皮素中劑量組比較，□P ＜0.05

圖2 各組肝組織FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白表達(dá)

3 討論

膽汁淤積病因多樣，研究[8-9]認(rèn)為病理性黃疸史、鞏膜黃染史、母乳喂養(yǎng)等均為其發(fā)生的危險(xiǎn)因素。膽汁淤積發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前臨床尚未達(dá)成一致，膽汁形成功能性缺陷、肝竇基側(cè)膜及毛細(xì)膽管膜變化、肝細(xì)胞骨架變化、緊密連接損傷、肝中膽管或毛細(xì)膽管阻塞等具有較高的認(rèn)可度[10-11]。研究[12-13]認(rèn)為使用ANIT 構(gòu)建膽汁淤積模型時(shí)導(dǎo)致的肝臟生化改變、病理損傷與人類相似，且與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。目前臨床治療膽汁淤積時(shí)通常在處理原發(fā)性疾病的基礎(chǔ)上加用糖皮質(zhì)激素口服，但用藥周期長，且易導(dǎo)致免疫力降低、水腫等不良反應(yīng)，家屬接受度低。

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素灌胃后第2、3、4 周槲皮素低、中、高劑量組血清ALT、ALP、GGT 水平均低于模型組，且隨著槲皮素使用劑量的增加及灌胃時(shí)間的延長，槲皮素3 個(gè)劑量組血清ALT、ALP、GGT 水平逐漸降低，提示槲皮素可改善膽汁淤積幼鼠肝功能；通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，槲皮素干預(yù)后肝細(xì)胞彌漫脂肪變性及碎片狀壞死，小膽管及匯管區(qū)纖維組織增生，大量炎性細(xì)胞浸潤等病理變化較模型組明顯減輕，其中槲皮素高劑量組減輕最為明顯，提示槲皮素可減輕膽汁淤積幼鼠肝組織病理損傷。烏吉木等[14]使用分子對(duì)接技術(shù)研究紅花抗膽汁淤積作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，紅花提取物之一槲皮素可作用于膽汁淤積2 個(gè)以上治療靶點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)膽紅素與膽汁酸代謝。本研究采用槲皮素干預(yù)膽汁淤積幼鼠后，血清ALT、ALP、GGT 水平顯著降低，且可減少肝細(xì)胞壞死、組織增生及炎性細(xì)胞浸潤，表明槲皮素治療膽汁淤積可改善幼鼠肝功能及肝組織病理變化。

FXR 屬激素核受體超家族成員，主要集中在腸、肝臟等具有膽汁酸代謝功能的組織器官中。研究[15]發(fā)現(xiàn)，膽汁酸是FXR 天然的內(nèi)源性配體，可激動(dòng)FXR，從而對(duì)自身合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。研究[16]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR 激動(dòng)劑GW4064 可糾正膽汁酸代謝異常，減輕肝毒性。MDR3、MRP2、OATP2 是FXR下游調(diào)控因子。MDR3主要表達(dá)于肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜，負(fù)責(zé)膽固醇與膽汁酸形成的微膠粒的轉(zhuǎn)運(yùn)，避免膽道系統(tǒng)損傷。研究[17]顯示，MDR3 基因敲除的小鼠可發(fā)展至肝硬化、膽汁淤積癥、膽石癥等進(jìn)行性肝臟疾病。MRP2 位于染色體10C24，是轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合型膽紅素的重要基因，參與肝細(xì)胞中物質(zhì)分布的調(diào)整。研究[18]認(rèn)為，F(xiàn)XR/RXR 異二聚體可結(jié)合MRP2 啟動(dòng)子中雌激素受體，從而誘導(dǎo)MRP2 表達(dá)上調(diào)。OATP2 表達(dá)于肝細(xì)胞基底膜外側(cè)，包含700 個(gè)左右氨基酸，通過鈉離子依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制易化膽紅素、膽汁酸等物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。OATP2 功能缺陷將導(dǎo)致膽紅素難以轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟從而積聚于體內(nèi)。FXR 可通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞核因子d-LST-1 活性從而調(diào)控OATP 家族成員表達(dá)，參與膽汁淤積癥發(fā)生與發(fā)展。上述研究均說明，F(xiàn)XR 介導(dǎo)的MDR3、MRP2、OATP2 膽汁酸代謝中具有重要作用。本研究采用不同劑量槲皮素干預(yù)膽汁淤積幼鼠模型后，F(xiàn)XR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于模型組，提示槲皮素可能通過上調(diào)FXR、MDR3、MRP2、OATP2 表達(dá)，發(fā)揮調(diào)整膽紅素、膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)作用。

綜上所述，槲皮素可改善膽汁淤積幼鼠肝功能，減輕肝組織病理變化，推測(cè)其作用機(jī)制可能與激活FXR 信號(hào)通路，上調(diào)MDR3、MRP2、OATP2 表達(dá)有關(guān)。FXR 信號(hào)通路作為槲皮素治療膽汁淤積幼鼠的信號(hào)調(diào)控通路，可為槲皮素相關(guān)藥物的研制及臨床應(yīng)用提供理論支持。