阿魏酸對高糖受損內(nèi)皮祖細胞生物學功能和分泌SOD的影響

熊 武，白 雪，肖 慧，吳玉娟，趙世情，尋 毅，蘭宏偉，袁 維*

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208）

內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一種來源于骨髓的血管干細胞，因其修復(fù)內(nèi)膜及促進血管新生的作用而備受關(guān)注。EPCs 能夠分化為內(nèi)皮細胞，并產(chǎn)生保護性的細胞因子和生長因子，參與內(nèi)皮修復(fù)，并通過遷移、歸巢到靶組織及結(jié)合到新生血管中參與血管生成[1]。自體EPCs 有望成為治療缺血性疾病血管重建和血管修復(fù)的新選擇[2]。然而糖尿病狀態(tài)下，體內(nèi)產(chǎn)生過量的自由基，導(dǎo)致組織氧化應(yīng)激?；钚匝醯倪^度產(chǎn)生及氧化應(yīng)激水平提高致EPCs功能受損。目前雖然干細胞療法已被廣泛研究，但基于干細胞治療糖尿病的臨床研究卻相對滯后[3-4]。雖然有大量數(shù)據(jù)表明某些糖尿病藥物可以改善“內(nèi)皮功能障礙”[5]，但關(guān)于糖尿病患者人類內(nèi)皮細胞的數(shù)據(jù)不多，給自體EPCs 治療帶來挑戰(zhàn)。因此需要建立一種全新策略來增強內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量及功能，為成功使用自體內(nèi)皮祖細胞治療提供可能。阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）是中藥當歸的主要活性成分，具有調(diào)節(jié)血糖、抗氧化和抗炎等多種藥理活性，可預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥[6]。FA 可通過減輕氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，從而改善內(nèi)皮功能障礙[6-7]。然而FA 對高糖受損EPCs 功能障礙的修復(fù)作用尚未報道。故本研究主要探討FA 在體外對高糖受損EPCs 生物學功能及對分泌SOD 的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit-8，CK04）購自日本同仁；DMEM（SH30022.01B）、PBS緩沖液購自美國Hyclone公司；胰酶（Gibco-15050-057）、胎牛血清（10270-106）購自美國GIBCO 公司；EGM ?-2MV 培養(yǎng)基（CC-3162）購自美國Lonza 公司；人淋巴細胞分離液（P8610）購自北京索萊寶科技有限公司；Dil-Ac-LDL 購自上海佰曄生物科技中心；FITC-UEA-1（L-9006）、DAPI溶液（D9542）、Fibronectin（F0635）購自Sigma 公司；Anti-CD31 抗體（ab28364）、山羊抗兔 IgG（FITC，ab6717）均購于英國Abcam 公司；Matrigel 基質(zhì)凝膠購自美國Becton Dickson 公司；Transwell 小室購自美國Corning公司；過超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；阿魏酸（Ferulic acid，F(xiàn)A）購自上海融禾公司。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng) 取健康足月新生兒臍帶血，采用密度梯度離心法，得到單個核細胞。使用EGM ?-2MV（Lonza）培養(yǎng)基重懸上述細胞，將細胞濃度調(diào)至5～6×106/mL 后接種于預(yù)包被纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）的六孔板中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 d 后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；以后每3～4 d 后換液1 次。細胞融合約90%則用胰酶消化按1:3 進行傳代。

1.2.2 EPCs 的鑒定 采用雙熒光染色法及免疫熒光細胞化學染色法等技術(shù)對培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞進行鑒定，具體方法同前[8]。

1.2.3 EPCs 分組及處理 高糖受損內(nèi)皮祖細胞：EPCs用30 mmo1/L 的葡萄糖的EGM-2 培養(yǎng)基培養(yǎng)5 天。將造模成功的EPCs 分別用0、1、2、4、8、16 mg/L 的FA 進行干預(yù)，確定FA 促高糖受損EPCs 增殖的最佳濃度。另將實驗分為3 組：實驗組、模型對照組、正常對照組（EPCs 用普通EGM-2 培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d）。實驗組用最佳濃度的FA 處理，模型組和正常組均用等體積的PBS 處理。

1.3 FA 對高糖受損EPCs 生物學功能的影響

1.3.1 FA 處理高糖受損EPCs 最佳濃度的選擇 取增殖活躍的細胞接種于96 孔板，加FA 使其終質(zhì)量濃度分別為0、1、2、4、8、16 mg/L，作用24 h 后用MTT法檢測細胞存活率，以確定最佳作用濃度。

1.3.2 增殖能力檢測 使用胰酶消化對數(shù)期的細胞，重懸細胞并計數(shù)，按1×105個/孔接種于96 孔板；在37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁；取指數(shù)生長期的細胞接種到96 孔板上，配制成100 μL 的細胞懸液；將培養(yǎng)板在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h；根據(jù)實驗分組加入8 mg/LFA 或PBS 進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24 h 后加入10 μL CCK8溶液，培養(yǎng)4 h。用酶標儀測定450 nm 處OD 值；本組實驗同時設(shè)置對照孔，每組設(shè)定3 復(fù)孔。

1.3.3 黏附能力檢測 使用胰酶消化貼壁細胞，使細胞充分脫落后離心重懸浮于500 μL 培基中并計數(shù)，然后將同等數(shù)目細胞接種于24 孔板，在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h 后，分別用8 mg/L FA 和PBS液干預(yù)，培養(yǎng)8 h 后，將同等數(shù)目的EPCs 接種在包被有大鼠纖維連接蛋白培養(yǎng)板中，隨后在37 ℃下培養(yǎng)30 min，在2 個隨機200 倍視野下計算貼壁細胞數(shù)目。

1.3.4 成血管能力檢測 Matrigel 基質(zhì)膠4℃過夜溶解后，采用M200無血清及生長因子補充物的培養(yǎng)基按1:1稀釋Matrigel 基質(zhì)膠，按50 μL/孔加入12 孔板，37℃孵箱放置30 min。使用胰酶消化對數(shù)期的各組細胞，DMEM 重懸，調(diào)整細胞密度至1×105個/μL，每孔加入1 mL 重懸液，待細胞貼壁加入8 mg/L FA 或PBS 進行干預(yù)。在37 ℃孵箱孵育培養(yǎng)24 h 后，倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)小管樣結(jié)構(gòu)。各組均隨機選取4 個視野計算小管數(shù)，取平均值。本組實驗重復(fù)3 次。

1.3.5 遷移能力檢測 先用Marker 筆在6 孔板背后每隔1 cm 畫一道橫線，橫穿過孔。每孔至少穿過5 條線。取對數(shù)生長期的EPCs，在孔中加入約5×105個細胞，預(yù)培養(yǎng)1 d 后用無菌200 μL 槍頭在培養(yǎng)孔底部中央畫一道痕跡，用PBS 洗去脫落的細胞。分別用含有8 mg/L FA 和PBS 液的無血清M199 完全培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇2 個不同視野，用顯微標尺，分別測量0 h 和24 h 的劃痕創(chuàng)面邊距并拍照。細胞遷移能力用遷移寬度表示。

1.3.6 SOD 檢測 細胞培養(yǎng)第5 天換液，添加8 mg/L FA 或PBS，每組濃度設(shè)置3 個復(fù)孔，藥物干預(yù)48 h 后，提取細胞上清液，根據(jù)試劑盒上的說明進行檢測。在15 min之內(nèi)，使用酶標儀測定450 nm的OD 值。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用 SPSS 21.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，2 組間均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1EPCs 的分離和培養(yǎng)細胞培養(yǎng)7 d 后，呈典型的鵝卵石樣，并表現(xiàn)出集落形態(tài)，中央細胞呈圓形，周邊細胞呈梭形，見圖1。

圖1 第7 天原代人EPCs 的形態(tài)（光鏡：A.×200；B.×400）

2.2 EPCs 的鑒定 原代人EPCs 細胞膜結(jié)合CD31 免疫熒光抗體呈綠色，細胞攝取DAPI核染呈藍色，融合圖像顯示膜染綠色熒光，核染藍色熒光，見圖2。細胞結(jié)合 FITC-UEA-I呈綠色，細胞攝取Dil-ac-LDL 呈紅色，兩者雙染呈橙黃色改變的細胞即為正常分化的EPCs，見圖3。

圖2 CD31 抗體聯(lián)合DAPI核染鑒定結(jié)果（熒光鏡，×400）

圖3 雙熒光染色鑒定結(jié)果（熒光鏡，×400）

2.3 FA 處理對高糖受損EPCs 增殖曲線的影響 隨著FA 處理濃度的增加，細胞活力逐漸升高，當FA 濃度為8 mg/L 時，細胞活動最高，16 mg/L 時逐漸降低，見圖4，因此本實驗選擇最佳濃度8 mg/L 作為后續(xù)實驗研究。

圖4 不同濃度FA 對高糖受損EPCs 增殖活性曲線圖

2.4 FA 對高糖受損EPCs 增殖、黏附、成血管及遷移能力的影響 實驗結(jié)果提示，與正常EPCs 相比，模型組EPCs增殖能力、黏附能力、成管能力（成管數(shù)目）、遷移能力（遷移率）明顯下降（P＜0.05），而FA干預(yù)后實驗組細胞增殖能力、黏附能力、成血管能力、遷移能力顯著增強（P＜0.05），見圖5，圖6，圖7，圖8。

圖5 FA 對高糖受損EPCs 增殖能力影響

圖6 FA 對高糖受損EPCs 黏附能力影響

圖7 FA 對高糖受損EPCs 成血管能力影響

圖8 FA 對高糖受損EPCs 遷移能力的影響

2.5 FA 對高糖受損EPCs 分泌SOD 的影響 ELISA檢測各組SOD 的活性，研究發(fā)現(xiàn)與正常組相比，高糖誘導(dǎo)損傷的 EPCs 的SOD 活性明顯下降（P＜0.05），8 mg/L 的FA 能夠提高高糖損傷EPCs 中SOD 的活性，但無明顯差異（P＞0.05），見圖9。

圖9 ELISA 檢測FA 對高糖受損EPCs 分泌SOD 的影響

3 討論

糖尿病是一種以慢性高血糖為特征的多病因代謝紊亂疾病[9]。糖尿病常見的長期并發(fā)癥之一是創(chuàng)面愈合障礙，約占糖尿病患者非創(chuàng)傷性截肢的50%。一項關(guān)于糖尿病患者截肢原因的回顧性研究提示創(chuàng)面愈合困難是81%的患者截肢的主要原因[10]。糖尿病患者的傷口愈合困難的主要原因是因為血管生成困難和新生血管的損害。EPCs 是來自造血干細胞系的干/祖細胞前體，通常被稱為循環(huán)祖細胞，是負責內(nèi)皮修復(fù)和新生血管生成的特殊細胞。在適宜環(huán)境下，EPCs 可以促進血管生成和血管修復(fù)，包括并入內(nèi)皮、釋放促進修復(fù)的生長因子和細胞因子[11]。研究[12]表明，在高血糖和糖尿病相關(guān)并發(fā)癥中，EPCs 的數(shù)量、功能和基因表達均受到損害。

糖尿病患者的高血糖狀態(tài)是內(nèi)皮功能障礙的主要原因。高糖通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致糖尿病患者EPCs功能障礙[13]，氧化應(yīng)激可促進EPCs 凋亡[14]，并引起 EPCs 活性、遷移能力及成管等功能下降[15]。高血糖通過線粒體電子傳遞鏈過量產(chǎn)生超氧陰離子活性氧（ROS），后者在細胞功能障礙和糖尿病并發(fā)癥的病理生理學中起重要作用。因此，慢性高血糖可能導(dǎo)致自由基產(chǎn)生過多，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，最終影響創(chuàng)面的愈合。故尋找抗氧化應(yīng)激的藥物可能是預(yù)防糖尿病血管穩(wěn)態(tài)受損的重要治療靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A 可顯著提高高糖受損EPCs 的增殖、黏附、成管和遷移能力，表明FA 能保護高糖誘導(dǎo)損傷的EPCs。分離糖尿病患者EPCs，在體外用FA處理改善其功能，再用于自體EPCs 移植，有望提高自體細胞移植療效，使其更加有效地促進血管生成和創(chuàng)面愈合，提高EPCs 治療效果，預(yù)防截肢。

本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下EPCs 中SOD 的活性明顯下降，8 mg/L 的FA 能夠提高其活性，但與對照組無明顯差異，可能與FA 的濃度選擇相關(guān)，亦可能與體外環(huán)境無法模擬體內(nèi)的具體環(huán)境有關(guān)。目前EPCs 治療尚未形成一套標準的表型和功能分析，亦未對細胞體內(nèi)外環(huán)境的綜合評價標準化。