腹瀉患者艱難梭菌檢測(cè)與分析

楊明，牛敏

（1.云南省曲靖市富源縣人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，云南 富源 655500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，云南 昆明 650032）

0 引言

艱難梭菌（Clostridium difficile，CD）為革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌，屬于嚴(yán)格的厭氧菌，對(duì)環(huán)境抵抗力較弱，對(duì)氧極度敏感，在空氣中極易死亡?？啥ㄖ灿谀c道，屬于條件致病菌，正常情況下不致病，當(dāng)大量使用抗菌藥物，腸道環(huán)境遭到破壞，受抑制的CD大量繁殖，所產(chǎn)生的毒素可引起抗生素相關(guān)性腹瀉（antibiotic-associated diarrhea，AAD）。CD主要產(chǎn)生艱難梭菌A毒素（ clostridiaum difficile toxin A，TcdA）和（或）B毒素（ clostridium difficile toxin B，TcdB）致病，TcdA為腸毒素，可與腸黏膜受體結(jié)合，引起局部腸黏膜血管的通透性增加，致絨毛損害，黏膜出血、壞死；TcdB是一種高致病的細(xì)胞毒素，能解聚腸黏膜肌動(dòng)蛋白，破壞細(xì)胞骨架，對(duì)腸道產(chǎn)生更大的破壞[1]。輕者可引起腹瀉，嚴(yán)重者發(fā)展為偽膜性腸炎甚至死亡。

谷氨酸脫氫酶（GDH）是CD的一種膜蛋白，產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株均含有該蛋白，與艱難梭菌是否產(chǎn)生毒素?zé)o關(guān)，穩(wěn)定性好，在各種類型CD中都具有高保守性和低突變率[2]。由于CD的培養(yǎng)條件要求高，許多醫(yī)院無(wú)法開展，對(duì)艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的診斷遇到極大的困難。目前認(rèn)為糞便GDH和毒素A/B檢測(cè)是CDI的一種有效的篩選試驗(yàn)，為了了解本院住院患者艱難梭菌的感染情況，本研究對(duì)住院腹瀉患者糞便標(biāo)本采用酶聯(lián)免疫熒光法進(jìn)行艱難梭菌GDH和毒素A/B的檢測(cè)，為診斷CDI提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源。收集2019年10月至2020年1月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院腹瀉患者糞便標(biāo)本62例。其中，男性患者41例，女性患者21例，患者在住院期間均使用過抗菌藥物治療且發(fā)生過腹瀉，抗菌藥物使用時(shí)間最短3 d，最長(zhǎng)20 d。糞便標(biāo)本均采用一次性使用采樣杯收集。

1.2 主要儀器和試劑。mini VIDAS熒光免疫分析儀（法國(guó)生物梅里埃公司），艱難梭菌谷氨酸脫羧酶（GDH）檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫熒光法）和艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫熒光法）均由法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)，一次性使用采樣杯（浙江拱東醫(yī)療器械股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 谷氨酸脫羧酶（glutamate dehydrogenase，GDH）檢測(cè)：艱難梭菌谷氨酸脫羧酶（GDH）檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫熒光法）采用兩步酶免夾心法與終點(diǎn)熒光檢測(cè)相結(jié)合的技術(shù)，檢測(cè)標(biāo)本中GDH含量，熒光強(qiáng)度隨標(biāo)本中GDH含量的增加而增強(qiáng)。嚴(yán)格按照說明書操作，稀便取200 mg加入200 μL蒸餾水中稀釋混勻備用，用移液器將水樣便反復(fù)抽吸混勻備用。然后將混勻好的200 μL液體糞便加入一清潔離心管內(nèi)。使用帶有一次性槍頭的移液器，并將1000 μL的預(yù)處理試劑（R1艱難梭菌）加入離心管內(nèi)，再次用移液器反復(fù)抽吸混勻。利用渦旋振蕩器充分混合標(biāo)本，確定標(biāo)本與預(yù)處理試劑（R1艱難梭菌）徹底混勻。在2℃～25℃環(huán)境中，以3000 g離心10 min，使用帶有一次性槍頭的移液器取300 μL上清液用于上機(jī)檢測(cè)。50 min檢測(cè)完畢后儀器會(huì)自動(dòng)分析結(jié)果，生成檢測(cè)值，并打印報(bào)告單。檢驗(yàn)結(jié)果：熒光值＜0.10為陰性，熒光值≥0.10為陽(yáng)性。

1.3.2 毒素A/B（TcdA/B）檢測(cè)：艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫熒光法）采用兩步酶免夾心法與終點(diǎn)熒光檢測(cè)相結(jié)合的技術(shù)，檢測(cè)標(biāo)本中毒素A/B抗原，熒光強(qiáng)度隨標(biāo)本中毒素A和B含量的升高而升高。嚴(yán)格按照說明書操作，稀便取200 mg加入200 μL蒸餾水中稀釋混勻備用，用移液器將水樣便反復(fù)抽吸混勻備用。然后將混勻好的200 μL液體糞便加入一清潔離心管內(nèi)。使用帶有一次性槍頭的移液器，并將1000 μL標(biāo)本稀釋液（R1）加入離心管內(nèi)，再次用移液器反復(fù)抽吸混勻。利用渦旋振蕩器充分混合標(biāo)本，確定標(biāo)本與標(biāo)本稀釋液（R1）徹底混勻。在2℃～25℃環(huán)境中，以12000 r離心5 min，使用帶有一次性槍頭的移液器取300 μL上清液用于上機(jī)檢測(cè)。75 min檢測(cè)完畢后儀器會(huì)自動(dòng)分析結(jié)果，生成檢測(cè)值，并打印報(bào)告單。檢驗(yàn)結(jié)果：熒光值＜0.13為陰性，0.13≤熒光值＜0.37為可疑，熒光值≥0.37為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 艱難梭菌GDH檢測(cè)。收集的62例糞便標(biāo)本中，GDH陽(yáng)性17例，陽(yáng)性率為27.4%（17/62）；17例GDH陽(yáng)性標(biāo)本中男性13例占76.5%（13/17），女性4例占23.5%（4/17）。未定型結(jié)腸炎患者的CD感染率41.2%（7/17）最高，使用氟喹諾酮類抗菌藥物治療的患者CD感染率41.2%（7/17）也是最高。

2.2 艱難梭菌毒素A/B檢測(cè)。17例GDH陽(yáng)性標(biāo)本中艱難梭菌毒素A/B陽(yáng)性5例，陽(yáng)性率為29.4%（5/17）。其中男性4例，占80%（4/5），女性1例，占20%（1/5）；可疑6例，占35.3%（6/17）。艱難梭菌毒素A/B的檢出率為8.1%（5/62）。5例GDH和毒素A/B均陽(yáng)性標(biāo)本臨床相關(guān)疾病見表1，抗菌藥物使用情況見表2。

表1 5例GDH和毒素A/B均陽(yáng)性標(biāo)本臨床相關(guān)疾病

表2 5例GDH和毒素A/B均陽(yáng)性標(biāo)本抗菌藥物使用情況

2.3 其他檢驗(yàn)。5例GDH和毒素A/B陽(yáng)性患者：外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和超敏C反應(yīng)蛋白均升高；糞便常規(guī)白細(xì)胞和潛血均為陽(yáng)性。

3 討論

隨著抗菌藥物的廣泛使用、CD經(jīng)多種途徑傳播及高毒性菌株的出現(xiàn)導(dǎo)致CDI的發(fā)病率和病死率不斷增高。近年來，CD已成為引起院內(nèi)感染腹瀉和腸炎的主要病原體，由于過度使用抗菌藥物，我國(guó)CDI逐年上升，在一篇薈萃分析中顯示，我國(guó)2009-2015年住院腹瀉患者艱難梭菌感染率是19%，不同國(guó)家和不同地區(qū)的感染率不同[3]?；颊呤褂每咕幬锖竽c道菌群遭到嚴(yán)重破壞，腸道菌群不能有效抑制CD的生長(zhǎng)，受抑制的CD大量繁殖，可引起腹瀉，嚴(yán)重者發(fā)展為抗生素相關(guān)性腹瀉、抗生素相關(guān)性結(jié)腸炎、偽膜性腸炎甚至死亡。CD引起的感染短期內(nèi)很難控制，治療時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。所以提高腹瀉患者早期糞便CD檢測(cè)對(duì)于CDI的確診和對(duì)癥治療及預(yù)防有重要意義。

CD的檢測(cè)方法主要有厭氧培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫法、核苷酸擴(kuò)增檢測(cè)等。培養(yǎng)法、核苷酸擴(kuò)增檢測(cè)都需要特殊的儀器設(shè)備、有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員、花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)、操作比較繁瑣、不易推廣[4]。目前檢測(cè)CDI最常推薦的方法是兩步法，第一步通過酶聯(lián)免疫熒光法檢測(cè)GDH進(jìn)行初篩；第二步對(duì)GDH陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行毒素檢測(cè)確診。酶聯(lián)免疫熒光法測(cè)定艱難梭菌GDH和毒素A/B具有靈敏度高，檢測(cè)周期短，操作簡(jiǎn)單，在臨床實(shí)驗(yàn)室易于開展等優(yōu)點(diǎn)。GDH是CD表面大量存在的保守抗原，其穩(wěn)定性和靈敏度較高，最大優(yōu)勢(shì)在于有很高的陰性預(yù)測(cè)值，通過查閱多篇文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，GDH檢測(cè)陰性預(yù)測(cè)值高達(dá)90%以上，這提示GDH檢測(cè)陰性的患者CDI的可能性極低，GDH陰性樣本可排除CDI，GDH陽(yáng)性標(biāo)本再進(jìn)行毒素測(cè)試來確定。GDH聯(lián)合毒素AB檢測(cè)有助于CDI患者的診斷。上述方法CDI判斷標(biāo)準(zhǔn)為：GDH與毒素A/B均陽(yáng)性確認(rèn)為CDI；GDH與毒素A/B均陰性排除CDI；GDH陽(yáng)性、毒素A/B陰性需用毒力生成培養(yǎng)試驗(yàn)（toxigenic culture，TGC）或核苷酸擴(kuò)增檢測(cè)方法進(jìn)行二次確認(rèn)檢測(cè)。

本次采集的住院患者62例糞便標(biāo)本中，GDH陽(yáng)性17例，陽(yáng)性率為27.4%（17/62），高于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的20.9%（34/163）[5]；毒素A/B的檢出率為8.1%（5/62），與國(guó)內(nèi)同類研究檢出率8.6%（6/70）[6]較為一致。17例GDH陽(yáng)性標(biāo)本中艱難梭菌毒素A/B陽(yáng)性5例，陽(yáng)性率為29.4%（5/17），低于于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的41.2%（14/34）[5]；可疑6例，占35.3%（6/17）。由于實(shí)驗(yàn)條件限制，本研究未對(duì)6份可疑陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行TGC或核苷酸擴(kuò)增檢測(cè)是否為產(chǎn)毒菌株，如果是產(chǎn)毒菌株將提高了本研究中艱難梭菌和毒素A/B檢出的陽(yáng)性率。本研究中檢測(cè)標(biāo)本例數(shù)較少，可能是造成陽(yáng)性率較低的主要原因之一。5例陽(yáng)性患者同時(shí)存在外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、超敏C反應(yīng)蛋白不同程度升高，糞便常規(guī)白細(xì)胞和潛血試驗(yàn)均為陽(yáng)性，這些結(jié)果均支持CDI的診斷。潰瘍性結(jié)腸炎患者CDI感染率高，這與本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果相符[7]；抗菌藥物使用情況顯示使用氟喹諾酮類藥物治療的患者CDI感染率明顯高于使用其他藥物治療的患者，與國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]；男性感染率明顯高于女性，提示性別可能是CDI的一個(gè)危險(xiǎn)因素，與一篇薈萃分析相吻合[3]。住院患者GDH檢出率較高，提示我院CD的攜帶者或感染者較高，需要加強(qiáng)對(duì)重點(diǎn)人群CDI的篩查與防控。GDH檢出陽(yáng)性率較高，毒素A/B檢出陽(yáng)性率較低，提示我們應(yīng)采用多種方法進(jìn)行毒素A/B的檢測(cè)，以提高CDI確診的陽(yáng)性率。隨著CDI患者的不斷增加，CDI問題引起廣泛關(guān)注。為預(yù)防控制出現(xiàn)CDI的持續(xù)上升，首先醫(yī)院通過采用手部衛(wèi)生護(hù)理、接觸防護(hù)、環(huán)境清潔和消毒等措施進(jìn)行有效預(yù)防，其次臨床中嚴(yán)格規(guī)范應(yīng)用抗菌藥物。同時(shí)，我們必須積極增加多種CD的檢測(cè)方法，提高CD的檢出率，為CDI的早期診斷、有效治療和感染防控提供依據(jù)。