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    以紅蕓豆與黃豆為氮源的枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵代謝組學(xué)比較分析

    2021-07-25 02:42:14高安平龔愛華
    關(guān)鍵詞:蕓豆納豆嘌呤

    高安平,龔愛華

    (江蘇省太倉市疾病預(yù)防控制中心,江蘇 太倉 215400)

    0 引言

    納豆通常以黃豆為原料,經(jīng)枯草芽孢桿菌在適宜條件下發(fā)酵制成的豆制品,其有效成分納豆激酶(Nattokinase,簡稱NK),是在發(fā)酵過程中由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶,能特異性水解纖維蛋白,從而溶解血栓[1]。

    目前,納豆激酶主要使用黃豆作為氮源來生產(chǎn),但黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中嘌呤含量高,限制了痛風(fēng)患者的使用。為此,本研究以紅蕓豆為培養(yǎng)基氮源,使用代謝組學(xué)方法,比較分析紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后代謝產(chǎn)物的差異。

    1 材料與方法

    1.1 菌種與材料。菌種:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗室分離,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC No.14434;材料:紅蕓豆及黃豆,市售;纖維蛋白原、凝血酶(2000 U/mg)購于沈陽拜英生物技術(shù)有限公司;尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品(1240IU/瓶)購于中國食品藥品檢定研究院;氯化鈉、磷酸二氫鉀、NaOH等試劑為分析純;乙腈、異丙醇、甲酸為色譜純。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 培養(yǎng)基配制:LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨1%,氯化鈉0.5%,酵母粉1%,PH 7.0。LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨1%,氯化鈉0.5%,酵母粉1%,瓊脂粉2%,PH 7.0。紅蕓豆發(fā)酵培養(yǎng)基:紅蕓豆粉2%,葡萄糖4%,氯化鈉1.5%,磷酸二氫鉀0.1%,磷酸氫二鉀0.1%,pH值為7.0,均為w/v。黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基:黃豆粉2%,葡萄糖4%,氯化鈉1.5%,磷酸二氫鉀0.1%,磷酸氫二鉀0.1%,pH值為7.0,均為w/v。以上培養(yǎng)基均經(jīng)121℃高壓滅菌20 min。

    1.2.2 種子液制備:菌種活化:取30μL保存于-80℃的甘油菌接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基,37℃,225rpm,培養(yǎng)6 h。四區(qū)劃線接種LB固體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)15h,挑取單菌落,接種3 mL LB液體培養(yǎng)基,37℃,225rpm培養(yǎng)6 h,得菌種子液。

    1.2.3 粗酶液制備:將種子液接種到pH值為7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量2%,在37℃,225rpm的條件進行發(fā)酵,第72 h取樣檢測。

    1.2.4 納豆激酶活性檢測:納豆激酶活性采用纖維蛋白平板法進行檢測,該方法于1952年由Astrup等人建立[2]。具體操作如下:將200μL纖維蛋白原溶液與60μL凝血酶溶液加入30 mL瓊脂糖溶液(1%)中,充分混勻,倒入平板,室溫放置1 h,形成纖維蛋白凝塊;用打孔器在纖維蛋白板上打孔,每孔加酶液10μL,置于37℃反應(yīng)15 h,取出后測定各溶解圈的垂直兩直徑,計算溶圈面積。以尿激酶的溶圈面積為橫坐標(biāo),尿激酶濃度為縱坐標(biāo),制作尿激酶酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)求出樣品的酶活力大小。

    1.2.5 嘌呤含量檢測:樣品制備:發(fā)酵結(jié)束后,收集發(fā)酵液于離心管中,12000 g離心10 min,取上清,經(jīng)凍干機凍干,即制得樣品。稱取一定量樣品于10 mL離心管,加2 mL+3.0%高氯酸溶液,快速混勻,100℃水浴60 min,冷卻后,使用2M氫氧化鉀調(diào)pH至7.0,再使用5.0%甲酸調(diào)pH至3.6,使用10 mm甲酸銨溶液(pH3.6)定容至10 mL,混勻,過0.22μm濾膜后待測。色譜條件:色譜柱為Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm×5μm);柱溫:30℃;流動相:10 mm甲酸銨(pH3.6)和甲醇(99%∶1%);進樣量:10μL;流速:1.0 mL/min;檢測波長:254 nm。

    1.2.6 代謝組學(xué)分析:樣品制備:發(fā)酵結(jié)束后,收集發(fā)酵液于離心管,12000 g離心10 min,取上清,凍干機凍干,即制得樣品。稱取50 mg樣品至5 mL離心管中,加入一顆直徑6 mm的研磨珠;加入400μL提取液(甲醇:水=4∶1(v∶v)),使用冷凍組織研磨儀研磨6 min(-l0℃,50 Hz);低溫超聲提取30 min(5℃,40 KHz),樣品靜置于-20℃,30 min;離心15 min(12000 g,4℃),取上清液上機分析。色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm i.d.,l.8μm;Waters,Milford,USA);流動相A為95%水+5%乙腈(含0.1% 甲酸),流動相B 為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水(含0.1% 甲酸);流速為0.40 mL/min,進樣量為2μL,柱溫為40℃。質(zhì)譜條件:樣品經(jīng)電噴霧電離,分別采用正、負離子掃描模式采集質(zhì)譜信號。

    2 結(jié)果

    2.1 紅蕓豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物中納豆激酶活性高。分別取1 mL紅蕓豆與黃豆發(fā)酵液于1.5 mLEP管中,12000 g離心5 min取上清,檢測到納豆激酶活性分別為13340 U/mL和9772 U/mL,紅蕓豆發(fā)酵代謝產(chǎn)物中的納豆激酶活性顯著高于黃豆發(fā)酵代謝產(chǎn)物中的納豆激酶活性。如圖1所示。

    圖1 紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物納豆激酶活性比較

    2.2 紅蕓豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物中嘌呤含量極低。經(jīng)檢測,紅蕓豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物嘌呤含量僅為4.17 mg/100 g,為低嘌呤產(chǎn)品,適用于痛風(fēng)患者。黃豆為氮源生產(chǎn)的納豆激酶中嘌呤含量報道為110.4 mg/100 g[3]。如圖2所示。

    圖2 紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物嘌呤含量檢測

    2.3 紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物差異較大。收集質(zhì)譜信號繪制Venn圖,陰離子模式下,紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中共有62種差異代謝物,陽離子模式下共有24種差異代謝物(圖3A)。紅蕓豆培養(yǎng)基的差異代謝物主要包含了含氧有機化合物、孕烯醇酮脂類及黃酮類物質(zhì),黃豆培養(yǎng)基的差異代謝物主要包含了類固醇類物質(zhì)及其衍生物、脂肪酸、羧酸及其衍生物(圖3B)。

    圖3 紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物差異分析

    2.4 紅蕓豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物中富含更多有益成分。對差異代謝物進行代謝物聚類分析,如圖4所示。本研究選取了表達豐度前50的數(shù)據(jù),相較于黃豆培養(yǎng)基,發(fā)酵后紅蕓豆培養(yǎng)基中共有30種代謝物含量較高,包括:圣草苷、透明質(zhì)酸、兒茶素、谷胱甘肽及三萜類化合物。發(fā)酵后的黃豆培養(yǎng)基中共有20種代謝物含量較高,主要為類固醇物質(zhì)與脂肪酸。

    圖4 紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵代謝物聚類分析

    3 討論

    納豆激酶作為一款安全有效的溶栓產(chǎn)品已廣泛使用,但由于用黃豆生產(chǎn)出的產(chǎn)品中嘌呤含量為110.4 mg/100 g,限制了痛風(fēng)患者的使用[4]。

    本研究使用紅蕓豆為氮源生產(chǎn)納豆激酶,其中嘌呤含量降至4.17 mg/100 g,活性提高為13340 U/mL。此外,相較于黃豆,以紅蕓豆為氮源代謝物中富含透明質(zhì)酸、兒茶素、谷胱甘肽、三萜類化合物,對維持人體健康具有更加積極的作用[5-6]。

    4 結(jié)論

    本研究通過比較紅蕓豆培養(yǎng)基與黃豆培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶活性、嘌呤含量以及代謝組學(xué)分析,首次證明了紅蕓豆是優(yōu)于黃豆的納豆激酶生產(chǎn)原料,為使用紅蕓豆為原料生產(chǎn)納豆激酶提供了有力的依據(jù)。

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