生物傳感器早期診斷假體周圍關(guān)節(jié)感染△

柴啟浩，李 偉，，滿振濤，，徐海倫，徐顯興

（1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科；山東濟南250021）

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療晚期髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的最成功和最常用的手術(shù)。它能明顯改善患者的關(guān)節(jié)功能，且只有不到10%的患者在術(shù)后出現(xiàn)遠(yuǎn)期并發(fā)癥［1］。由于人口老齡化和運動損傷的年輕患者數(shù)量日益增多，全球人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的手術(shù)量也常年上升，其術(shù)后的并發(fā)癥問題受到廣泛重視。而術(shù)后并發(fā)癥中最嚴(yán)重的是假體周圍感染（periprosthetic joint infection,PJI），據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，在初次全膝或全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生PJI的概率為1%～4%［2，3］。雖然PJI的發(fā)生率較低，但常引起患者預(yù)后不良，重者需要進(jìn)行復(fù)雜的關(guān)節(jié)翻修術(shù)，既會降低患者的生活質(zhì)量，又會給患者和社會造成巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)［4］。PJI翻修術(shù)的死亡率顯著高于無菌性翻修術(shù)和初次關(guān)節(jié)置換術(shù)，而且患者再次住院的風(fēng)險也高［5］。所以，如何早期迅速準(zhǔn)確診斷PJI一直是骨關(guān)節(jié)科的熱點難題。目前，PJI的診斷方法有血清學(xué)診斷、關(guān)節(jié)液生物標(biāo)記物檢測及細(xì)菌培養(yǎng)等，其中血清學(xué)診斷主要檢測血清中血沉、C反應(yīng)蛋白等炎癥因子，但其特異性不高。有不少文獻(xiàn)報道如α-防御素、白細(xì)胞介素、乳鐵蛋白等關(guān)節(jié)液生物標(biāo)記物對PJI有較高的診斷價值［6～8］。但是，對于PJI的早期診斷來說，其敏感性略顯不足。最近，電化學(xué)生物傳感器因特異性高、檢測速度快、費用較少等優(yōu)點在細(xì)菌檢測領(lǐng)域受到研究者廣泛重視［9］。

1 PJI的診斷標(biāo)準(zhǔn)

目前被醫(yī)療界廣泛接受的PJI診斷標(biāo)準(zhǔn)是由骨與肌肉感染協(xié)會提出并經(jīng)2013年國際共識會議（Inter?national Consensus Meeting,ICM）修訂的專家指南（表1）［10］。然而，該指南仍存有不足：如各項指標(biāo)的權(quán)重并未區(qū)分，類似于竇道的發(fā)現(xiàn)與病理切片的高倍鏡觀察與計數(shù)等診斷指標(biāo)的判斷都存在一定的主觀性。同時，隨著醫(yī)學(xué)上對PJI理解的深入以及檢測手段的發(fā)展，2013年P(guān)JI診斷標(biāo)準(zhǔn)的時效性有必要進(jìn)一步提高。因此，2018年P(guān)arvizi等［11］提出了一種基于評分系統(tǒng)的PJI新定義。隨后，ICM也基于此新定義制定了PJI的最新診斷標(biāo)準(zhǔn)（表2）。新診斷標(biāo)準(zhǔn)增加了D-二聚體、α-防御素等新檢測指標(biāo)，同時賦予了次要標(biāo)準(zhǔn)中各個指標(biāo)一定的分值，然后采用累計總分制來診斷PJI。然而，新診斷標(biāo)準(zhǔn)中的兩項主要標(biāo)準(zhǔn)并沒有改變。由此可見，PJI的病原菌檢測是極為重要的。

表1 ICM 2013 PJI診斷標(biāo)準(zhǔn)及診斷閾值

表2 ICM 2018 PJI新診斷標(biāo)準(zhǔn)及診斷閾值

2 PJI目前常用的診斷方法

檢測血清中C反應(yīng)蛋白和血沉等血清學(xué)指標(biāo)是PJI的經(jīng)典診斷方法。關(guān)節(jié)置換術(shù)后三個月C反應(yīng)蛋白和血沉升高，尤其是C反應(yīng)蛋白的升高，常常提示有感染的可能。但血沉和C反應(yīng)蛋白是非特異性炎性指標(biāo)［12］，當(dāng)機體存在其他部位感染或患有風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病時，則會干擾PJI的診斷。Pérezprieto等［13］研究指出，類似于血沉和C反應(yīng)蛋白之類的非特異性血清學(xué)指標(biāo)，尤其在診斷低毒性和慢性PJI方面，其診斷價值可能不大，而且誤診率較高。α-防御素是近年來研究較熱的一項關(guān)節(jié)液生物標(biāo)記物，同時也是2018年ICM新標(biāo)準(zhǔn)中新增的次要標(biāo)準(zhǔn)之一。有研究表明α-防御素的敏感性和特異性均高于血沉和C反應(yīng)蛋白［14］，而且不受炎性疾病的干擾［15］，但其單獨用于PJI的快速診斷時，可能會出現(xiàn)假陽性和假陰性［16］，并且費用較高，每次檢測需760美元［17］。影像學(xué)檢查如X線片、CT、MRI等也是PJI診斷中不可或缺的方法，但常常需要結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他檢查綜合判斷才能發(fā)揮作用。由于PJI的復(fù)雜性，單一的診斷方法往往無法快速準(zhǔn)確地做出診斷。然而，不論是2013年還是2018年的ICM診斷標(biāo)準(zhǔn)，受累關(guān)節(jié)兩次假體周圍培養(yǎng)物為同一細(xì)菌都是PJI的主要診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，研究高特異性、高敏感性的細(xì)菌檢測方法成為重中之重。

3 PJI的病原菌分布

了解PJI的病原菌分布，可以為其細(xì)菌檢測提供好的方向。相關(guān)文獻(xiàn)報道，PJI的病原菌分布從高到低依次是凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、混合菌群、鏈球菌、革蘭陰性菌、腸球菌和厭氧菌［18，19］。但不同國家和地區(qū)之間，致病菌的分布或許存在差異，如一項歐洲和美國骨科中心的研究顯示，在美國，PJI的首位致病菌是金黃色葡萄球菌，其在膝關(guān)節(jié)PJI中占29.60%，在髖關(guān)節(jié)PJI中占32.6%，而歐洲PJI的首位致病菌則是凝固酶陰性葡萄球菌，其在膝關(guān)節(jié)PJI中占37.0%，在髖關(guān)節(jié)PJI中占40.7%［20］。國內(nèi)彭慧明等［21］對 2014～2016 年北京市 9家醫(yī)院的318例PJI患者的病原菌做了統(tǒng)計，結(jié)果顯示革蘭陽性菌209例（65.7%），革蘭陰性菌29例（9.1%），真菌10例（3.1%），非結(jié)核分枝桿菌3例（0.9%），培養(yǎng)陰性72例（22.6%），這與陳志［22］的研究大致相同。由此可見，國內(nèi)外的PJI患者的致病菌大都以革蘭陽性菌為主，尤其是金黃色葡萄球菌。

4 電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用現(xiàn)況

4.1 電化學(xué)生物傳感器的概述

電化學(xué)生物傳感器具有檢測快速、特異性高等特點，從而成為一種較為理想的快速檢測體系［23］。而阻抗型電化學(xué)傳感器因其具有無標(biāo)記檢測、檢測速度快、可以微型化等特點備受關(guān)注［24］。阻抗型生物傳感器可在其電極表面固定如抗菌肽、抗體、核酸等特異性受體，因為細(xì)菌具有絕緣性，待細(xì)菌識別受體并與之結(jié)合后，電極表面的電阻將會增加從而導(dǎo)致電流減小，所以可以利用這種阻值的變化來檢測細(xì)菌。為了形象地反映電極表面阻值的變化情況，常使用電化學(xué)阻抗譜技術(shù)［25］。利用此技術(shù)來檢測細(xì)菌常通過以下2種方式進(jìn)行：（1）檢測細(xì)菌在電化學(xué)池中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物所引起溶液電導(dǎo)率的變化；（2）檢測目標(biāo)細(xì)菌與電極表面受體相互作用所引起的阻抗變化。

4.2 阻抗型電化學(xué)生物傳感器的細(xì)菌檢測應(yīng)用

Laczka等［26］制作了一種基于叉指電極陣列（in?terdigitated electrode array,IDEA）的阻抗型電化學(xué)傳感器，他們通過在叉指電極上固定大腸桿菌的特異性抗體來檢測大腸桿菌。結(jié)果顯示，這款傳感器在40分鐘就檢測出了大腸桿菌，檢出限為103cells/ml，而對照組使用酶聯(lián)免疫吸附測定法所測得的最低濃度為105cells/ml。但是，此實驗的結(jié)果是在磷酸鹽緩沖液中得到的，未在真實樣品中進(jìn)行。2011年，Bratov等［27］發(fā)明了一種3D-IDEA阻抗型傳感器，其通過在叉指電極的每個電極之間用二氧化硅絕緣隔開，使該傳感器的靈敏度大大提升。隨后，Hoyosnogrés等［28］用這種傳感器來檢測口腔種植體周圍炎癥中最重要的致病菌血鏈球菌，他們在電極表面固定hLf1-11抗菌肽，這種抗菌肽對血鏈球菌有顯著的抑菌作用，然后分別在KCL溶液和人工唾液中檢測該傳感器對血鏈球菌的檢出限。結(jié)果顯示，檢出限分別為3.5×10 CFU/ml（KCL溶液）和8.6×102CFU/ml（人工唾液）且僅用了1 h，此傳感器有望用于口腔種植體感染的早期診斷。Broseloliu等［29］也用3D-IDEA阻抗型傳感器檢測了大腸桿菌O157：H7，他們在電極表面固定高度特異識別大腸桿菌O157：H7外膜蛋白的DNA適配體，最后僅用30 min就檢測出了磷酸鹽緩沖液中的大腸桿菌，檢出限為2.9×102CFU/ml，而且該傳感器可重復(fù)使用。Jijie等［30］研發(fā)的電化學(xué)生物傳感器，可檢測尿路感染的致病菌大腸桿菌UT189。他們將大腸桿菌UT189的特異性抗體固定在由還原性氧化石墨烯/聚乙烯亞胺薄膜修飾的金電極表面，該傳感器的檢出限為10 CFU/ml（水樣品），而且在血清和尿液樣品中，該傳感器的電化學(xué)信號與水樣品中的趨勢相同，顯示了其作為尿路感染一項診斷手段的可能性。以上研究表明阻抗型電化學(xué)生物傳感器在細(xì)菌檢測方面具有良好的應(yīng)用前景，然而尚未發(fā)現(xiàn)將該技術(shù)應(yīng)用于PJI的細(xì)菌檢測中，未來仍需要進(jìn)一步研究。

5 小結(jié)與展望

總之，PJI作為關(guān)節(jié)置換術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，目前仍缺乏一種高效的方法來對其進(jìn)行早期快速的診斷。然而，除了觀察到存在與假體相通的竇道之外，兩次假體周圍培養(yǎng)物為同一細(xì)菌仍是ICM對于PJI的定義中至今未變的主要標(biāo)準(zhǔn)，由此可以看出細(xì)菌檢測或許可以成為PJI診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。常規(guī)的細(xì)菌檢測技術(shù)，如細(xì)菌培養(yǎng)、生化測定等，既缺乏足夠的靈敏度和特異性，又十分耗時。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)雖然可以進(jìn)行快速分析，但也存在復(fù)雜的引物設(shè)計、費用較高等劣勢。酶聯(lián)免疫吸附測定法可用于大批樣品的定性及半定量分析，具有檢測迅速、特異性高等特點，然而，樣品收集及操作過程易受污染，一般用于科研研究。綜上所述，電化學(xué)生物傳感器擁有費用低、檢測快、特異性高、檢出限低等優(yōu)勢，而且已在口腔種植體周圍炎、尿路感染以及其他領(lǐng)域開展了相關(guān)致病菌的快速檢測。目前還尚無針對關(guān)節(jié)PJI方面的生物傳感器，未來可以研發(fā)PJI每個致病菌的特異性生物傳感器，這或?qū)⒊蔀镻JI早期快速診斷的有力工具。