地塞米松對(duì)急性胰腺炎胰腺組織中ERK信號(hào)通路及miRNA-216a的影響

廖永暉，何勇，葉榮強(qiáng)，戴啟心，鐘鼎文

（贛州市人民醫(yī)院 肝膽胰外科，江西 贛州 341000）

0 引言

急性胰腺炎（Acute Pancreatitis，AP）的發(fā)病原因主要是患者自身存在的多種疾病，導(dǎo)致自身發(fā)生炎癥的反應(yīng)，AP具有突發(fā)性。在AP模型的胰腺中，地塞米松（DEX）對(duì)信號(hào)通路的影響可能起關(guān)鍵作用[1]，例如Notch等信號(hào)通路具有一定程度的影響[2]。本文擬對(duì)DEX對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞保護(hù)機(jī)制做相應(yīng)論述。急性胰腺炎是一種炎癥反應(yīng)，發(fā)病原因較多，表現(xiàn)為胰腺內(nèi)有胰酶激活，導(dǎo)致胰腺組織出現(xiàn)水腫、自身消化、出血，嚴(yán)重的還會(huì)發(fā)生壞死，對(duì)人類的生命安全造成不利影響。一旦發(fā)病，患者血清中的TNF-α，IL-6等基因被激活，這些基因與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)；此外，p53，NF-κB，Bax，Bcl-2等基因表達(dá)也會(huì)發(fā)生變化，這些基因與凋亡有關(guān)。研究所用的大鼠AP模型的Notch信號(hào)通路激活后，Notch表達(dá)和Hesl蛋白表達(dá)明顯上升。Notch表達(dá)升高幅度過大后對(duì)胰腺細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，在其影響下AP更加嚴(yán)重。經(jīng)研究結(jié)果可見，地塞米松（DEX）存在對(duì)NF-κB活化產(chǎn)生抑制作用的可能性，并同時(shí)作用于Survivin的表達(dá)，對(duì)其抗凋亡作用產(chǎn)生抑制效果，從而導(dǎo)致胰腺細(xì)胞凋亡更為明顯。但是目前并未出現(xiàn)以Notch信號(hào)通路為媒介出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡應(yīng)用地塞米松后有所緩解的有關(guān)報(bào)道。此次研究所采用的小鼠急性胰腺炎模型是用蛙皮素建立完成的，以此對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡采用地塞米松治療所產(chǎn)生的作用機(jī)制展開深入研究。

1 材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。此次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)象為30只健康成年SD大鼠，重量均為200～250 g，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合贛州市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器。Bio-Rad SDS-PAGE型電泳分離儀（美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；全自動(dòng)生化檢測儀（日本株式會(huì)社日立制作所）；LightCycler LC480Real-Time PCR system（瑞士羅氏公司）。

1.3 動(dòng)物模型的制備。通過參考相關(guān)文獻(xiàn)建立小鼠AP模型，并對(duì)其加以適當(dāng)修改，具體參考對(duì)象為楊飛云等研究人員，蛙皮素與生理鹽水混合予以稀釋，使其濃度為10μg/mL，將其經(jīng)腹腔為小鼠注射，劑量為50μg/kg，注射次數(shù)共計(jì)3次，每隔2 h注射1次，經(jīng)腹腔注射地塞米松，劑量分別為0.5 mL/kg，0.4 mL/kg，0.6 mL/kg，0.8 mL/kg和1 mL/kg，對(duì)小鼠血清中的TNF-α濃度進(jìn)行檢測，以此完成梯度濃度的建立；準(zhǔn)確給出注射濃度，DEX組小鼠經(jīng)腹腔注射蛙皮素后隨即注射地塞米松；AP組小鼠僅注射生理鹽水，連續(xù)注射3次。兩組小鼠完成最后一次注射后將其處死，對(duì)其血液和胰腺組織進(jìn)行收集。

1.4 TNF-α和IL-6檢測。采用ELISA對(duì)所有動(dòng)物血清實(shí)施檢測，明確其中TNF-α和IL-6的含量，抽取動(dòng)物血液作離心處理獲取血清，在-20℃溫度下保存，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒檢測血清中的TNF-α和IL-6含量，具體操作步驟參照試劑盒附帶的使用說明書，采用由Molecular Devices公司生產(chǎn)的酶標(biāo)儀置于450 nm對(duì)其吸光值進(jìn)行測定。

1.5 Western blot。提取組織總蛋白，采用Western blot法對(duì)收集到的胰腺組織進(jìn)行檢測，明確其中Bax，Hesl，Notchl和Bcl-2蛋白表達(dá)所發(fā)生的變化，將研缽經(jīng)高壓消毒，放入胰腺組織，加適量液氮，將其研磨成末，然后倒入1.5 mL Ep管中，再倒入RIPA裂解液，在冰上靜置30 min，在4℃溫度條件下做離心處理，持續(xù)15 min，提出上清，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對(duì)其蛋白濃度進(jìn)行測定。采用SDS-PAGE電泳將蛋白分離，置于NC膜，分別按照1∶500、1∶500、1∶500和1∶1000的比例對(duì)Bax抗體，Hesl抗體，Notchl抗體Bcl-2抗體在4℃溫度條件下進(jìn)行孵育，間隔一夜，作曝光處理，完成圖像采集對(duì)灰度值進(jìn)行分析。

1.6 RT-qPCR。對(duì)組織中總RNA進(jìn)行提取，采用RTqPCR法對(duì)胰腺組織中的檢測胰腺組織中Bax，Hesl，Notchl和Bcl-2mRNA的表達(dá)變化情況予以檢測，將研缽經(jīng)高壓消毒，放入胰腺組織，加適量液氮，將其研磨成末，然后倒入1.5 mL Ep管中，倒入Trizol Reagent，完成總RNA提取，并對(duì)其純度和濃度進(jìn)行檢測，逆轉(zhuǎn)錄RNA，形成cDNA，具體操作步驟參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中附帶的使用說明書。引物序列的設(shè)計(jì)與合成工作交由上海生工來完成，擴(kuò)增模板為cDNA，RT-qPCR反應(yīng)條件為預(yù)變性、變性、退火和延伸，分別為94℃ 、94℃、55℃和72℃，持續(xù)時(shí)間分別為30 s、5 s、30 s和30 s，反復(fù)循環(huán)40次。

1.7 方法

1.7.1 造模。30只大鼠隨機(jī)分配，AP組10只，DEX+AP組10只，空白對(duì)照組10只。制作質(zhì)量濃度為10μg· mL-1的蛙皮素生理鹽水溶液，并將其通過以兩小時(shí)為間隔三次連續(xù)注射的方式注射到大鼠腹腔，劑量為50μg·kg-1；另一組注射蛙皮素后，再注射質(zhì)量濃度為5μg·mL-1的DEX，劑量1 mL·kg-1；對(duì)照組為生理鹽水分三次定量注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，對(duì)各組大鼠腹腔動(dòng)脈取血樣后處死大鼠，切取胰腺組織。

1.7.2 血清中AMY和LPS的水平測定：離心大鼠血液，以3000 r·min-1lixin，10 min后，將其清液取出，具體操作方式以試劑盒說明書為準(zhǔn)，按照速率法對(duì)AMY和LPS的水平進(jìn)行檢測。

1.7.3 血清促炎因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和TGF-β1水平測定：離心大鼠血液，以3000r·min-1lixin，10 min后，將其清液取出，測定各組胰腺組織和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的水平采用Elisa法。

1.7.4 胰腺組織中miRNA-216amRNA表達(dá)的測定：將待測的各大鼠胰腺組織研成粉末狀，靜置于1.5 mLep管中，待檢出的胰腺組織樣本中mirna-216a的表達(dá)，將直接通過RT-qPCR法。首先在每個(gè)樣本中分別加入適量的trizol試劑，然后從其中提取出一個(gè)總RNA，依照說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為主要基礎(chǔ)的仿真模板對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行擴(kuò)充。

1.7.5 胰腺組織中p-ERK1/ERK2的蛋白表達(dá)：大鼠胰腺組織中p-ERK1/ERK2蛋白表達(dá)情況用WesternBlot法檢測。此次實(shí)驗(yàn)中采用bca試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了檢測，采用bio-radsds-page電泳分離蛋白技術(shù)后將其移至nc膜，分別添加I抗4℃孵育過夜，I抗稀釋后所用的濃度分別是gapdh抗體（1∶10000）、p-erk1/erk2抗體（1∶500），然后在室溫環(huán)境下加入熒光II抗體孵育2 h，然后再利用odyssey雙色紅外激光技術(shù)儀器，采集圖像分析灰度的平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS 18.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示方法為（±s），多樣本比較為單因素方差分析，兩樣本比較為t，P＜0.05為數(shù)據(jù)相比差異有意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中AMY與LPS水平變化情況。AP組血清中AMY與LPS水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；DEX組血清中二者的水平均顯著低于AP組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清中AMY與LPS水平變化背景情況（±s）

表1 各組大鼠血清中AMY與LPS水平變化背景情況（±s）

注：與對(duì)照組比較**P＜0.01；與AP組比較*P＜0.05。

項(xiàng)目 對(duì)照組 AP組 DEX組AMY/U·L-1 827.15±19.88 5778.36±107.43** 3640.25±87.22*LPS/U·L-1 389.47±11.54 2599.36±92.46** 1867.64±72.28*

2.2 各組大鼠胰腺組織及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平情況。AP組大鼠血清和胰腺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1明顯呈現(xiàn)出升高趨勢（P＜0.01）；DEX組大鼠血清和胰腺組織TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1明顯呈現(xiàn)出降低趨勢（P＜0.05）。見表2、3。

表2 各組大鼠胰腺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平情況（±s）

表2 各組大鼠胰腺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平情況（±s）

注：與對(duì)照組比較**P＜0.01；與AP組比較*P＜0.05。

組別 TNF-α/ng·mL-1 IL-1β/ng·mL-1 IL-6/pg·mL-1 TGF-β1/pg·mL-1對(duì)照組 9.31±2.22 20.17±1.99 8.94±1.75 58.48±2.89 AP組 67.43±4.17**72.62±2.18**30.81±1.94**139.47±4.94**DEX組 35.79±2.59* 46.92±1.88* 19.32±1.86* 99.48±2.98*

2.3 各組大鼠胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達(dá)結(jié)果。DEX組大鼠胰腺組織中miRNA-216amRNA的表達(dá)為（2.315±0.239），顯著低于AP組（P＜0.05）。AP組大鼠胰腺組織中miR-NA-216amRNA的表達(dá)為（2.787±0.422），顯著高于對(duì)照組（P＜0.001）。

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1檢測水平情況（±s）

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1檢測水平情況（±s）

注：與對(duì)照組比較**P＜0.01；與AP組比較*P＜0.05。

組別 TNF-α/TGF-β1/pg·mL-1對(duì)照組 2.42±0.56 60.25±4.33 1.80±0.92 23.74±1.76 AP組 15.32±0.71**255.87±5.59**13.73±1.53**87.75±2.79**DEX組 9.33±0.72* 111.46±4.32* 8.45±1.14* 36.88±2.31*ng·mL-1 IL-6/pg·mL-1 IL-1β/ng·mL-1

2.4 各組大鼠胰腺組織中p-ERK1/ERK2的蛋白表達(dá)。AP組大鼠胰腺組織中p-ERK1/ERK2的蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，DEX組大鼠胰腺組織中p-ERK1/ERK2的蛋白表達(dá)明顯低于AP組（P＜0.05），見圖1。

圖1 p-ERK1/ERK2蛋白在胰腺組織中的表達(dá)

3 討論

在臨床中，急性胰腺炎是一種高發(fā)性疾病，其臨床癥狀主要為疼痛，患者的腹部會(huì)出現(xiàn)反復(fù)疼痛且痛感劇烈，大部分患者因該病癥選擇就醫(yī)，患者的生活質(zhì)量明顯下降。急性胰腺炎所產(chǎn)生的疼痛屬于內(nèi)臟性神經(jīng)病理性痛，有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在急性胰腺炎患者中，出現(xiàn)腹痛癥狀的患者的占80%～90%，病程緩慢發(fā)展，即使病癥得以改善或者被治愈也無法完全消除，因此出現(xiàn)嚴(yán)重的疼痛現(xiàn)象后，對(duì)患者預(yù)后及轉(zhuǎn)歸會(huì)產(chǎn)生不利影響。急性胰腺炎所引發(fā)的疼痛會(huì)給治療帶來一定的困難，所以對(duì)患者展開原發(fā)病治療時(shí)，也不能忽視止痛治療。但是直至今日，急性胰腺炎的相關(guān)發(fā)病機(jī)制、臨床過程、病理生理還存在很多未知因素，在實(shí)施治療時(shí)也以慢性胰腺炎及并發(fā)癥為主，在治療疼痛時(shí)通常采用傳統(tǒng)鎮(zhèn)痛藥物，不僅治療效果不理想，還會(huì)產(chǎn)生較大的副作用。所以，為了提高急性胰腺炎的治療效果，改善患者的生活質(zhì)量，就要明確其發(fā)病機(jī)制，研究出更有針對(duì)性的治療方法。AP的發(fā)生發(fā)展是過程極為復(fù)雜，涉及到的因素比較廣泛[2]，其最顯著因素有以下三點(diǎn)，第一點(diǎn)是活化的胰酶，第二點(diǎn)是細(xì)胞因子，第三點(diǎn)是趨化因子。在AP模型胰腺中，地塞米松（DEX）對(duì)其Notch信號(hào)通路有一定程度的影響[3]，而且在組織細(xì)胞的生長、發(fā)育、增殖和分化中過程中，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號(hào)通路也起決定性作用，時(shí)可對(duì)免疫功能、炎癥反應(yīng)等起到調(diào)節(jié)作用[4]。TGF-β有3種亞型，分別為TGF-β1、轉(zhuǎn)化生長因子kβ2（TGF-β2）和轉(zhuǎn)化生長因子β3（TGF-β3）。本項(xiàng)研究結(jié)果表明，AP組大鼠與其他對(duì)照組大鼠胰腺組織中miRNA-216a的表達(dá)相較而言，AP組顯著高于對(duì)照組，在使用DEX治療之后，與AP組比較，動(dòng)物胰腺組織中miRNA-216a的表達(dá)顯著降低[5]，說明DEX可降低AP動(dòng)物胰腺組織中miRNA-216a的表達(dá)。

miRNA屬于非編碼的RNA，當(dāng)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)或者免疫應(yīng)答時(shí)，可對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，其作用顯著。在AP模型大鼠的 miRNA-216amRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯上升，在急性胰腺炎的整個(gè)發(fā)病過程均有參與，在急性胰腺炎診斷時(shí)有參考價(jià)值。地塞米松屬于皮質(zhì)類固醇，可用于對(duì)抗炎癥或改善微循環(huán)，臨床中可用于急性胰腺炎的治療。有研究指出，地塞米松可使Bax基因蛋白的表達(dá)升高致使胰腺細(xì)胞凋亡，緩解炎癥。又有研究發(fā)現(xiàn)，在急性胰腺炎病理過程中，對(duì)miRNA -216a的表達(dá)進(jìn)行抑制，對(duì)胰腺的病理學(xué)損傷有一定的緩解作用。此次研究通過對(duì)動(dòng)物胰腺組織中miRNA -216amRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組，AP組動(dòng)物胰腺組織中的miRNA -216amRNA水平更高，這一結(jié)果與臨床研究無差異，經(jīng)治療后，DEX組的動(dòng)物胰腺組織中miRNA -216amRNA比AP組下降更為明顯，可見地塞米松可抑制miRNA -216amRNA表達(dá)，同時(shí)可作用于miRNA-216a的表達(dá)。DEX對(duì)NF -κB活性進(jìn)行抑制，使胰腺腺泡出現(xiàn)凋亡，降低其壞死率。

本文對(duì)AP中DEX對(duì)ERK信號(hào)通路影響進(jìn)行了研究，使用DEX治療后，信號(hào)通路中p-ERK1/ERK2的蛋白表達(dá)程明顯降低狀態(tài)。同時(shí)，使用DEX治療后，動(dòng)物胰腺組織與血清中的TNF-α、IL-6及IL-1β、TGF-β1的水平均顯著降低，結(jié)果提示，AP發(fā)生時(shí)，DEX可通過抑制TGF-β1的水平，進(jìn)而抑制ERK1/ERK2蛋白的磷酸化，而抑制TGF-β1/ERK信號(hào)通路的激活；AP過程中，參與炎癥反應(yīng)的炎癥細(xì)胞因子主要有IL-1β、TNF-α、IL-6與TGF-β1等[5]，本研究中DEX通過抑制TGF-β1/ERK信號(hào)通路的激活，阻礙炎癥因子的形成與發(fā)揮作用，從而達(dá)到減輕對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞損傷的效果。

綜上所述，DEX通過對(duì)抑制TGF-β1等炎癥因子的表達(dá)，抑制ERK1/ERK2蛋白磷酸化，達(dá)到抑制TGF-β1/ERK信號(hào)通路激活的效果；從另一方面來說，DEX可以有效抑制miRNA-216a的表達(dá)，炎癥因子合成和釋放功能減弱，胰腺腺泡細(xì)胞被有效保護(hù)。