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      miR-3182調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的作用機(jī)制研究

      2021-07-22 10:20:58木尼拉馬哈德哈斯也提艾力帕麗達(dá)帕拉哈提
      河北醫(yī)藥 2021年14期
      關(guān)鍵詞:熒光素酶細(xì)胞系靶向

      木尼拉·馬哈德 哈斯也提·艾力 帕麗達(dá)·帕拉哈提

      結(jié)直腸癌是一種發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤。近年來隨著生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,結(jié)直腸癌患者的預(yù)后生存率得到一定的提高,但仍是導(dǎo)致人類死亡率的主要原因之一[1]。臨床上大部分患者確診時(shí),已錯(cuò)過最佳治療時(shí)間,導(dǎo)致預(yù)后較差[2]。分子靶向治療具有較強(qiáng)的特異性以及較小的不良反應(yīng),因此成為提高結(jié)直腸癌患者預(yù)后的研究重點(diǎn)。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類含18~25個(gè)核苷酸的非編碼RNA,可通過結(jié)合于特定基因3,端非翻譯區(qū)(Untranslated region,3,UTR),調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄或翻譯過程,影響細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生命過程,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。miR-3182是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種 miRNA,其在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá),但其對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響還未知[3,4]。為探究miR-3182在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用以及分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平進(jìn)行研究,探討miR-3182對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及調(diào)控機(jī)制,以期為結(jié)直腸癌病理演進(jìn)分子機(jī)制的進(jìn)一步闡釋提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)主要材料 結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、SW480、SW620)購自北納生物有限公司,DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol試劑購自美國Thermo公司,Lipofectamine 2000購自美國Life Technologies公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR(Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)購自南京凱基生物有限公司,噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)購自美國Bio Basic Inc公司;Transwell小室購自美國Corning公司,miR-3182 模擬物以及對照質(zhì)粒購自上海吉?jiǎng)P生物有限公司。酶標(biāo)儀購自美國Bio-BRAD公司,7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

      1.2 細(xì)胞的培養(yǎng) 結(jié)直腸癌多種細(xì)胞系(HCT116、SW480、SW620)采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育,倒置顯微鏡觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞系生長狀態(tài),每2~3天加入胰酶消化、傳代。

      1.3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 選取對數(shù)期SW620細(xì)胞,隨機(jī)分為對照組、miR-NC組、miR-3182組。在Lipofectamine 2000說明書指示下,miR-NC組、miR-3182組分別將對照質(zhì)粒和miR-3182組模擬物轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞中,置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),對照組為正常培養(yǎng)的SW620細(xì)胞。

      1.4 qPCR實(shí)驗(yàn) 采用Trizol試劑提取對照組、miR-NC組、miR-3182組SW620細(xì)胞中總RNA,加入反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA。以GAPDH為參照,進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件設(shè)置為95℃ 5 min,95℃ 15 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min,40個(gè)循環(huán),結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。其中,miR-3182引物以及GAPDH引物由上海生工合成。見表1。

      表1 引物序列

      1.5 MTT實(shí)驗(yàn) 收集對照組、miR-NC組、miR-3182組SW620細(xì)胞,將(1~3)×103個(gè)SW620細(xì)胞接種于96孔板,37℃分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,每孔SW620細(xì)胞中加入無血清培養(yǎng)基200 μl以及MTT(5 mg/ml) 20 μl,37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h,每孔SW620細(xì)胞加入二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)150 μl,37℃孵育10 min,振蕩15 min,酶標(biāo)儀在570 nm測定吸光值,記為A值。

      1.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 收集對照組、miR-NC組、miR-3182組轉(zhuǎn)染24 h的SW620細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基重懸,Transwell小室膜中預(yù)先覆蓋Matrigel基質(zhì)膠稀釋液(1∶5 DMEM培養(yǎng)基稀釋),而細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室無需覆蓋Matrigel基質(zhì)膠。將200 μl含有2×105個(gè)SW620細(xì)胞浮液加入Transwell上室,另外將600 μl含10%胎牛血清培養(yǎng)基加入下室,37℃培養(yǎng)24 h;棉花輕輕擦拭Transwell上室,甲醛固定、染色各30 min,拍照、計(jì)數(shù)5個(gè)區(qū)域細(xì)胞,取平均值。

      1.7 靶基因的預(yù)測和驗(yàn)證 采用在線數(shù)據(jù)庫TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測miR-3182下游靶基因,選取與腫瘤生長相關(guān)的基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)作為研究對象。雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-3182與Bcl-2的靶向關(guān)系,野生型(Bcl-2-wt)和突變型(Bcl-2-mut)Bcl-2的3,-UTR熒光素酶報(bào)告載體由上海吉?jiǎng)P生物有限公司構(gòu)建,并分別與miR-3182 模擬物和對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,37℃培養(yǎng)48 h,收集SW620細(xì)胞,測定雙熒光素酶的相對活性。

      2 結(jié)果

      2.1 miR-3182在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)量 與人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞(FHC)相比,miR-3182在結(jié)直腸癌多種細(xì)胞系(HCT116、SW480、SW620)中表達(dá)量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中在SW620細(xì)胞中的表達(dá)量相對較低。見表2。

      表2 miR-3182在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)量

      2.2 miR-3182模擬物對miR-3182表達(dá)量的影響 與對照組相比,轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒對SW620細(xì)胞中miR-3182表達(dá)量無顯著影響,但miR-3182模擬物可顯著增加SW620細(xì)胞中miR-3182表達(dá)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

      表3 miR-3182模擬物對miR-3182表達(dá)量的影響

      2.3 上調(diào)miR-3182對SW620細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比,轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒對SW620細(xì)胞增殖無顯著影響,但miR-3182模擬物隨著時(shí)間的增加顯著抑制SW620細(xì)胞增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

      表4 上調(diào)miR-3182對SW620細(xì)胞增殖的影響

      2.4 上調(diào)miR-3182對細(xì)胞侵襲、遷移的影響 與對照組相比,轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒對SW620細(xì)胞遷移、侵襲無顯著影響,但miR-3182模擬物顯著抑制SW620細(xì)胞遷移、侵襲,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5,圖1。

      表5 上調(diào)miR-3182對SW620細(xì)胞侵襲、遷移的影響 個(gè),

      圖1 上調(diào)miR-3182對SW620細(xì)胞遷移、侵襲的影響(×200)

      2.5 miR-3182靶基因的預(yù)測 Bcl-2 3,UTR區(qū)域(4654-4661)部分堿基可特異性結(jié)合于miR-3182,表明Bcl-2可能是miR-3182的潛在靶基因。見圖2。

      圖2 Targetscan預(yù)測miR-3182下游靶基因

      2.6 miR-3182靶向調(diào)控Bcl-2 miR-3182模擬物與Bcl-2-wt共轉(zhuǎn)染較miR-NC組與Bcl-2-wt共轉(zhuǎn)染顯著降低SW620細(xì)胞的熒光素酶活性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但miR-3182模擬物與Bcl-2-mut共轉(zhuǎn)染與miR-NC組與Bcl-2-mut共轉(zhuǎn)染對SW620細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化。見表6。

      表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

      3 討論

      結(jié)直腸癌的病理演進(jìn)過程是一個(gè)多階段、多基因參與的復(fù)雜生物學(xué)過程。在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中,多個(gè)原癌基因以及抑癌基因的表達(dá)量發(fā)生明顯變化。早期研究證實(shí),在結(jié)直腸癌組織生長、轉(zhuǎn)移過程中,miRNA的表達(dá)量發(fā)生異常變化[5,6]。miRNA可靶向調(diào)節(jié)多種在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程具有重要作用的基因,通過降解或者抑制其翻譯,影響其表達(dá)量,從而參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等過程。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),miR-3182參與結(jié)直腸癌進(jìn)展,具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的能力。值得注意的是,其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)緊密相關(guān),為結(jié)直腸癌分子機(jī)制的深入研究提供了新的啟示。

      近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-3182在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,表達(dá)量發(fā)生顯著變化,并且調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)特性[7-10]。miR-3182在不同類型的癌癥中起著抑癌或致癌的功能[11-14],例如,與匹配的癌旁組織或正常成骨細(xì)胞系相比,miR-3182在骨肉瘤組織或細(xì)胞系中的表達(dá)量顯著下調(diào),可通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)水平抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和腫瘤生長,進(jìn)而產(chǎn)生抑制腫瘤的作用。在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中,miR-3182表達(dá)量明顯增加,有助于鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移,可作為預(yù)后監(jiān)測的潛在分子標(biāo)記物[15]。在三陰性乳腺癌中,miR-3182的表達(dá)量降低,通過靶向調(diào)節(jié)mTOR和S6K1的表達(dá)量,影響腫瘤組織的生長。在本實(shí)驗(yàn)中通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn),miR-3182在結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、SW480、SW620)中的表達(dá)量降低,與梁高鋒等[7,16]的報(bào)道一致,這也表明miR-3182參與結(jié)直腸癌病理演進(jìn)過程。其中在結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞中的表達(dá)量相對降低,因此將SW620細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對象。此前已有資料顯示,在結(jié)直腸癌中,梁高鋒等[7]利用高通量測序檢測到miR-3182表達(dá)量明顯降低,但其具體的作用尚不十分清楚。為進(jìn)一步探究miR-3182的具體作用,本研究將miR-3182模擬物轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞中,qPCR檢測轉(zhuǎn)染效果發(fā)現(xiàn),miR-3182模擬物可顯著上調(diào)SW620細(xì)胞中miR-3182的表達(dá)量,說明成功構(gòu)建上調(diào)miR-3182的細(xì)胞;MTT和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,上調(diào)miR-3182的表達(dá)量明顯抑制SW620細(xì)胞增殖、侵襲、遷移,與前人報(bào)道[14]相符,提示miR-3182在結(jié)直腸癌病理演進(jìn)過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。

      Bcl-2是一種常見的癌基因,在腫瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮促進(jìn)作用,有效抑制細(xì)胞的凋亡[17]。研究表明,Bcl-2是細(xì)胞多種凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同樞紐,在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-20]。為進(jìn)一步探究miR-3182調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測以及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),Bcl-2是miR-3182的下游靶基因,表明miR-3182可能通過靶向調(diào)控Bcl-2影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。

      綜上所述,miR-3182在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中表達(dá)量降低;上調(diào)miR-3182顯著抑制SW620細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,其作用機(jī)制可能是通過靶向影響B(tài)cl-2表達(dá)量;但本實(shí)驗(yàn)僅在細(xì)胞水平探究miR-3182的作用以及潛在分子機(jī)制,未來會在多株細(xì)胞系以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究miR-3182的具體作用,為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供潛在標(biāo)志物。

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