飛燕草素對光誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜感光細胞661W鐵過載的調(diào)控作用△

傅曉穎 鄧曉敏 陳倩云 彭佳媛 杜旌暢 朱彥鋒 余小平

光是視覺產(chǎn)生和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的基本要素，但過量光刺激可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷(RPD)。研究證實，光誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激參與RPD 的始動環(huán)節(jié)[1]。在視網(wǎng)膜感光細胞中，鐵離子作為重要的光轉(zhuǎn)導(dǎo)酶輔助因子，能維持細胞正常代謝，而細胞內(nèi)過量鐵離子可通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，從而誘發(fā)氧化應(yīng)激，加速視網(wǎng)膜退化或某些遺傳性疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。因此，平衡的鐵代謝狀態(tài)對于維持視覺功能及預(yù)防視力損傷至關(guān)重要。

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)主要是由黃斑區(qū)老化及視網(wǎng)膜光損傷而導(dǎo)致的一種退行性視網(wǎng)膜疾病[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，AMD患者視網(wǎng)膜色素上皮中鐵濃度增加，并繼發(fā)性引起光感受器退化[4]。使用鐵螯合劑可以螯合視網(wǎng)膜中的鐵離子，減少鐵誘導(dǎo)的氧化損傷，具有預(yù)防或治療某些視網(wǎng)膜疾病的潛力[5-6]?；ㄇ嗨厥且活惥哂卸喾咏Y(jié)構(gòu)和強抗氧化性的天然黃酮類化合物。飛燕草素(Delphinidin)是花青素中抗氧化效應(yīng)最強的代表成分，其表現(xiàn)出抗炎[7]、抗增殖和抗腫瘤[8]等多種生物活性。本課題組前期研究結(jié)果證實，在小鼠視網(wǎng)膜感光細胞661W與SD大鼠中，Delphinidin能通過調(diào)控氧化-抗氧化系統(tǒng)有效減輕細胞光化學(xué)損傷[9-10]。而RPD中是否存在過量鐵離子，Delphinidin能否通過調(diào)節(jié)鐵離子含量減少光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜感光細胞死亡尚不清楚。故本研究以661W細胞為研究對象，以鐵螯合劑DFP為陽性對照，探討Delphinidin調(diào)節(jié)鐵代謝保護光化學(xué)損傷661W細胞的可能效應(yīng)與機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器(1)主要試劑:Delphinidin、DFP(美國Sigma公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁公司)，細胞凋亡與壞死檢測試劑盒(中國碧云天公司)，鈣黃綠素-乙酰羥甲基酯熒光探針(Calcein-AM，英國Abcam公司)，BODIPYTM 581/591 C11熒光探針(美國Thermo Fisher Scientific公司)，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)抗體(英國Abcam公司)，鐵蛋白輕鏈(FTL)抗體、二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1(DMT1)抗體、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Fpn)抗體(中國Proteintech公司)，鐵蛋白重鏈1(FTH1)抗體、兔二抗、鼠二抗(美國CST公司)，GAPDH(中國ZSGB-BIO公司)。(2)主要儀器:CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；CMC-Ⅱ型細胞光照儀(自制，專利號：ZL201821939405.1)；Power Wave XS2酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；IX71倒置熒光相差顯微鏡(日本 Olympus 公司)；QuanteonTM流式細胞儀(美國ACEA Biosciences公司)；電泳儀、ChemiDoc化學(xué)發(fā)光凝膠成像檢測儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 細胞來源與培養(yǎng)方法661W細胞購于上海奧陸生物有限公司(源于美國俄克拉何馬州大學(xué))，采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素),置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 藥物濃度篩選661W細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約為5×103個細胞，分別加入100 μL的含5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1、80 μmol·L-1、160 μmol·L-1Delphinidin或DFP的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，按CCK-8試劑盒說明書步驟操作，酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm的光密度(D)，計算細胞活力，篩選Delphinidin和DFP的最佳作用濃度用于后續(xù)實驗。

1.4 實驗分組收集對數(shù)生長期的661W細胞進行分組處理，其中，(1) Control組：避光培養(yǎng)細胞24 h，換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；(2) Light組：(2000±200)lx白色熒光照射細胞24 h，換新培養(yǎng)基繼續(xù)光照24 h；(3) Light + DFP組：(2000±200)lx白色熒光照射細胞24 h，換為含20 μmol·L-1DFP的培養(yǎng)基繼續(xù)光照24 h；(4)Light+Delphinidin組：(2000±200)lx白色熒光照射細胞24 h，換為含5 μmol·L-1Delphinidin的培養(yǎng)基繼續(xù)光照24 h；(5) Control+Delphinidin組：避光培養(yǎng)細胞24 h，換為含5 μmol·L-1Delphinidin的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 檢測方法

1.5.1 各組661W細胞活力檢測661W細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約為5×103個細胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。分組處理后收集各組細胞，按CCK-8試劑盒說明書步驟操作，酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm的D，計算細胞活力。

1.5.2 各組661W細胞膜受損程度661W細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約為5×103個細胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。分組處理后收集各組細胞，使用細胞凋亡與壞死檢測試劑盒中Hoechst染液與PI染液4 ℃孵育各組細胞30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 各組661W細胞鐵含量測定661W細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔約為1.5×105個細胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。分組處理后收集各組細胞，用500 μL的1 μmol·L-1Calcein-AM熒光探針染液重懸細胞后，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀FITC通道檢測各組細胞平均熒光強度(MFI)。

1.5.4 各組661W細胞脂質(zhì)過氧化物含量測定661W細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔約為1.5×105個細胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。分組處理后收集各組細胞，用500 μL的4 μmol·L-1BODIPYTM 581/591 C11熒光探針染液重懸細胞后，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀FITC通道檢測各組細胞MFI。

1.5.5 Western blot檢測各組661 W細胞鐵代謝相關(guān)蛋白表達分組處理后收集各組細胞，IP裂解液裂解細胞后，提取細胞內(nèi)總蛋白并以BCA法測定蛋白濃度。每組取50 μg蛋白進行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入DMT1、TfR1、FTL、FTH1、Fpn一抗稀釋液搖床4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入相應(yīng)二抗稀釋液，再經(jīng)ECL顯影，ImageJ 軟件分析各組細胞條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Delphinidin和DFP對光損傷661W細胞的保護作用CCK-8法檢測不同濃度Delphinidin和DFP對661W細胞活力的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，Delphinidin IC50為124.7 μmol·L-1，其濃度在20 μmol·L-1以下能促進細胞生長；DFP IC50為137.2 μmol·L-1，其濃度在40 μmol·L-1以下能促進細胞生長。由此，設(shè)定Delphinidin與DFP的作用濃度分別為5 μmol·L-1和20 μmol·L-1。CCK-8法檢測Delphinidin和DFP對光損傷后661W細胞活力的影響，結(jié)果顯示： 與Control組相比，Light組細胞活力明顯降低(P<0.05)，Control + Delphinidin組細胞活力明顯增加(P<0.05)；與Light組相比，Light + DFP組和Light + Delphinidin組細胞活力均明顯升高(均為P<0.05)，表明DFP和Delphinidin可保護661W細胞減少光照損傷(表1)。

圖1 Delphinidin、DFP對661W細胞的劑量-反應(yīng)曲線 A:Delphinidin對661W細胞的劑量-反應(yīng)曲線；B:DFP對661W細胞的劑量-反應(yīng)曲線。

2.2 Delphinidin改善光損傷661W細胞的細胞膜功能Hoechst-PI染色能檢測早期死亡細胞膜的通透性狀態(tài)。PI無法穿透細胞膜，對于具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色；而Hoechst可穿透細胞膜，染色后凋亡細胞熒光表達明顯增強。熒光顯微鏡下可見：Control組細胞未發(fā)生凋亡反應(yīng)，細胞核呈現(xiàn)均勻一致的弱藍色低熒光，Light組細胞熒光染色強度明顯增強，細胞膜損傷嚴(yán)重，細胞死亡數(shù)量增加；與Light組相比，Light + DFP組和Light + Delphinidin組細胞熒光染色強度明顯降低，細胞死亡數(shù)量減少，細胞膜受損程度降低(圖2)。

圖2 各組661W細胞的Hoechst-PI雙染圖(×200) 正常細胞為弱紅色熒光加弱藍色熒光，凋亡細胞染色質(zhì)會固縮呈亮藍色熒光。

2.3 Delphinidin降低光損傷661W細胞鐵含量Calcein-AM熒光探針能夠進入細胞，結(jié)合細胞內(nèi)鐵離子后即被淬滅。因此，熒光信號強弱與細胞內(nèi)鐵含量成反比。各組661 W細胞鐵含量檢測結(jié)果表明：與Control組相比，Light組細胞鐵含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Light組細胞內(nèi)存在鐵蓄積現(xiàn)象；與Control組相比，Control + Delphinidin組細胞鐵含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Light組相比，Light + DFP組和Light + Delphinidin組細胞鐵含量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，Delphinidin和DFP可減少光誘導(dǎo)的鐵過載(圖3和表1)。

圖3 各組661W細胞鐵含量

表1 各組細胞活力、Calcein-AM MFI、BODIPYTM 581/591 C11 MFI

2.4 Delphinidin減少光損傷661W細胞脂質(zhì)過氧化物含量采用BODIPYTM 581/591 C11熒光探針檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物水平，結(jié)果表明： 與Control組相比，Light組細胞MFI顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，光照能誘導(dǎo)細胞脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)；與Control組相比，Control + Delphinidin組細胞MFI無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Light組相比，Light + DFP組和Light + Delphinidin組細胞MFI均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，Delphinidin和DFP可減少661W細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生(圖4和表1)。

圖4 各組661W細胞脂質(zhì)過氧化物水平

2.5 Delphinidin對光損傷661W細胞鐵代謝相關(guān)蛋白的影響Western blot檢測結(jié)果表明：與Control組相比，Light組細胞DMT1、TfR1、FTL、FTH1蛋白表達水平均升高，F(xiàn)pn蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；與Control組相比，Control+Delphinidin組細胞DMT1、TfR1和Fpn蛋白表達水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，F(xiàn)TL、FTH1蛋白表達無明顯變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)；與Light組相比，Light + DFP組和Light + Delphinidin組細胞TfR1、Fpn蛋白表達水平均升高，DMT1、FTL和FTH1蛋白表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(圖5和表2)。

圖5 各組細胞鐵代謝相關(guān)蛋白表達情況

表2 各組細胞鐵代謝相關(guān)蛋白表達水平

3 討論

高強度或長時間光照會促使感光細胞線粒體生成大量ROS。ROS既是氧化產(chǎn)物，又可作為第二信使通過誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)或各種蛋白表達來激活不同信號通路，最終導(dǎo)致細胞死亡[11]。花青素存在于多種果蔬花卉中。由于Delphinidin B環(huán)上有三個羥基結(jié)構(gòu)，其抗氧化能力最強[12]。本課題組前期研究證明Delphinidin可提高抗氧化酶系活性，并通過調(diào)節(jié)凋亡通路相關(guān)蛋白(iNOS、Bax、細胞色素 C、Cleaved-Caspase-3)的表達來降低光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷[9-10]。

因661W細胞具有視錐細胞的生化特性[13]，故本研究以661W細胞建立RPD體外模型。結(jié)果顯示，與Control組相比，Light組細胞活力顯著降低，Hoechst-PI熒光染色強度顯著增強，感光細胞的細胞膜受損明顯，細胞死亡數(shù)量增加。不同濃度Delphinidin與DFP處理661W細胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Delphinidin與DFP最佳作用濃度分別為5 μmol·L-1和20 μmol·L-1。與Light組相比，Light+DFP組與Light+Delphinidin組細胞活力均明顯提高，Hoechst-PI熒光染色強度顯著降低，提示Delphinidin能降低光誘導(dǎo)的細胞損傷，維持細胞膜完整性，減少細胞死亡。同時與Control組相比，Control + Delphinidin組細胞活力顯著升高，表明5 μmol·L-1Delphinidin處理對661W細胞無毒副作用。

Daruich等[14]研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜脫離患者眼中鐵含量隨脫離時間的延長而增加，且與視力恢復(fù)不良相關(guān)。AMD患者視網(wǎng)膜色素上皮及Bruch膜中的鐵含量增高，視網(wǎng)膜鐵過載會加重AMD發(fā)展[15]。Imamura等[16]用2500 lx白色熒光燈照射661W細胞1 h、3 h、6 h和12 h并檢測亞鐵離子水平，發(fā)現(xiàn)光照超過6 h亞鐵離子含量顯著升高。本研究檢測661W細胞鐵含量的結(jié)果與之相似，與Control組相比，Light組細胞鐵含量顯著增加，視網(wǎng)膜存在鐵蓄積現(xiàn)象，而與Light組相比，DFP或Delphinidin干預(yù)能明顯減少661 W細胞鐵含量，維護視網(wǎng)膜鐵代謝穩(wěn)態(tài)。

2012年，Dixon等[17]首次報道了鐵死亡(ferroptosis)這一非凋亡性的新型細胞死亡方式。其特征是依賴鐵離子的ROS積累，引起細胞氧化還原水平失衡，進而發(fā)生膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷細胞膜的完整性，導(dǎo)致細胞死亡[18]。本課題組前期研究結(jié)果表明，Delphinidin可減少ROS含量，調(diào)節(jié)細胞抗氧化水平[9]。本研究結(jié)果證實，光照后細胞脂質(zhì)過氧化物水平增多，DFP或Delphinidin能通過降低鐵過載引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜氧化損傷。此外，其他花色苷或葉黃素也可增加抗氧化酶的表達[19-20]，減少脂質(zhì)過氧化物含量，保護視網(wǎng)膜色素上皮細胞[21]。

細胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)由多種調(diào)控因子參與。鐵離子主要與轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)和TfR1結(jié)合進入細胞[22-23]，然后通過DMT1進入細胞質(zhì)，細胞內(nèi)過量鐵儲存于FTL和FTH1內(nèi)。臨床研究結(jié)果顯示，AMD患者的血液中Tf和TfR1濃度均顯著增加[24]，AMD患者血液中鐵蓄積與鐵的攝取異常有關(guān)。Hadziahmetovic等[25]通過微陣列分析小鼠視網(wǎng)膜光損傷中鐵調(diào)節(jié)基因的變化，發(fā)現(xiàn)TfR1和FTL基因表達上調(diào)。Imamura等[16]研究證明，在光損傷661W細胞體外模型中，TfR1和FTH1基因表達均隨光照時間依賴性增加。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，Light組細胞DMT1、TfR1、FTL和FTH1蛋白表達水平均升高；與Light組相比，DFP或Delphinidin作用后DMT1、FTL和FTH1蛋白表達水平均降低，提示Delphinidin可以通過下調(diào)鐵離子的攝取與儲存，改善細胞鐵過載。但DFP或Delphinidin作用后TfR1蛋白表達仍顯著增加，提示Delphinidin作用后細胞內(nèi)鐵離子減少會促使TfR1蛋白表達代償性增加。Fpn是目前發(fā)現(xiàn)的細胞內(nèi)唯一的排鐵蛋白。Theurl等[26]提出，鐵離子可通過血管內(nèi)皮中的Fpn進入視網(wǎng)膜，再由Müller細胞轉(zhuǎn)運至光感受器細胞外段，最終從視網(wǎng)膜色素上皮排出，形成鐵離子從光感受器到血液的循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，Light組細胞Fpn蛋白表達水平降低，表明光照誘導(dǎo)視網(wǎng)膜鐵含量升高可增加鐵調(diào)素表達，從而引起血管內(nèi)皮細胞Fpn的降解，限制鐵離子進入視網(wǎng)膜。而與Light組相比，DFP或Delphinidin干預(yù)后Fpn蛋白表達水平回升，表明Delphinidin作用后細胞內(nèi)鐵含量降低，為增加細胞內(nèi)可利用鐵離子，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞Fpn蛋白表達升高。以上結(jié)果表明，Delphinidin能從鐵的攝取、儲存、利用等方面調(diào)控鐵代謝相關(guān)蛋白的表達，維持661W細胞的鐵穩(wěn)態(tài)。

綜上，Delphinidin可通過調(diào)節(jié)鐵代謝相關(guān)蛋白表達，緩解光誘導(dǎo)的661W細胞鐵過載，進而抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少視網(wǎng)膜氧化損傷。本研究證明RPD的發(fā)生機制中涉及視網(wǎng)膜感光細胞鐵過載。但RPD中鐵過載是否發(fā)展為鐵死亡，還需從胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體途徑、脂質(zhì)代謝途徑、鐵死亡調(diào)節(jié)因子等多方面進一步探討。本研究為黃酮類化合物預(yù)防和治療RPD提供了新的理論依據(jù)，對探討鐵死亡在RPD中的作用機制提供一定參考。