脂褐素成分A2E誘導人視網(wǎng)膜色素上皮細胞自噬及損傷的研究△

張晶晶 陳云珍 黃旅珍 陳莉

年齡相關性黃斑變性(AMD)是一種臨床上常見的黃斑變性類疾病，可造成進行性、不可逆性中心視力喪失，是全球發(fā)達國家成年人致盲的首要疾病之一[1-3]。隨著我國人口老齡化進程的日益加劇，由AMD所致的盲目人群數(shù)量激增，給整個社會帶來巨大的精神及經(jīng)濟負擔。AMD的病理改變主要是視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞和光感受器細胞的丟失和損傷，最終造成視力損害。脂褐素又稱“老年色素”，在眼部主要存在于RPE細胞內(nèi)，是細胞在衰老過程中逐漸積累的一種棕黃色物質(zhì)[4]。脂褐素含有十余種不同的成分，包括各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及代謝殘骸等，近年來人們逐漸認識到N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺(A2E)是脂褐素中重要的基團[5]。脂褐素及其主要成分A2E作為不完全降解的殘余物長期堆積在RPE細胞內(nèi)，會造成細胞的衰老及凋亡，是黃斑變性發(fā)生、發(fā)展的主要因素之一[6]。

自噬是細胞對于環(huán)境變化的有效反應，對新陳代謝具有舉足輕重的作用。一方面，自噬可以作為一種防御機制應對因饑餓、缺氧、氧化應激等對細胞造成的損傷，清除有缺陷的蛋白或者細胞器；另一方面，如果自噬被過度激活，它也可以啟動“自噬性細胞死亡(autophagic cell death)”程序或者和凋亡協(xié)同作用導致細胞的死亡[7]。因此，自噬是一把雙刃劍?，F(xiàn)有的研究已發(fā)現(xiàn)自噬與AMD病理機制相關，可能參與了RPE細胞氧化應激后的清除過程[8]，但對于自噬在RPE細胞損傷和AMD發(fā)病機制中的確切作用尚不十分清楚。因此，本研究旨在探討自噬對人RPE細胞內(nèi)脂褐素成分A2E誘導的細胞損傷和炎癥反應中的作用，并為治療AMD提供了一種可能的策略。

1 材料與方法

1.1 材料人RPE細胞系ARPE-19購于美國ATCC公司。A2E由北京大學人民醫(yī)院眼科實驗室黃旅珍研究員饋贈。DMEM-F12培養(yǎng)液(Sigma-Aldrich，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；CCK-8細胞活性檢測試劑盒(Dojindo，日本)；ProcartaPlex細胞因子檢測試劑盒(Panomics，美國)；兔抗人LC3抗體、兔抗人Beclin-1抗體、兔抗人p62抗體(Abcam，美國)；兔抗人β-actin抗體、山羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology，美國)；小鼠抗兔熒光二抗(Invitrogen，美國)；Luminex 200儀器、電泳儀、聚丙烯酰胺垂直電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(BioRad，美國)；超微切片機(Wetzlar，德國)；熒光顯微鏡(Nikon，日本)；透射電子顯微鏡(FEI，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理ARPE-19細胞采用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM-F12完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d更換一次細胞培養(yǎng)液，當細胞培養(yǎng)至 80%～90%融合時，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化傳代進行后續(xù)實驗。

1.2.2 A2E作用濃度篩選ARPE-19細胞按每孔5000個接種于96孔板中，每組設5個復孔。分別用含A2E濃度為0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1的DMEM-F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，每種濃度分別設1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 5個時間點終止培養(yǎng)，之后用PBS清洗兩次后更換為100 μL含100 g·L-1CCK-8的DMEM-F12完全培養(yǎng)液繼續(xù)孵育2 h，酶標儀檢測450 nm波長的光密度，實驗獨立重復3次。篩選出A2E的適宜作用濃度進行后續(xù)實驗研究。

1.2.3 細胞因子檢測用含20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)ARPE-19細胞6 h 和12 h后終止培養(yǎng)，吸取細胞培養(yǎng)上清液進行細胞因子檢測，同時用不含A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)的ARPE-19細胞作為對照。根據(jù)ProcartaPlex細胞因子檢測試劑盒說明書的操作步驟，選擇與AMD發(fā)病密切相關的10種細胞因子和趨化因子進行檢測，被檢測的因子包括：細胞間黏附分子(ICAM)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-10、促血管生成素-2(Ang-2)、胎盤生長因子(PIGF)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)以及血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)。在濾板的每孔中加入50 μL抗體珠，用洗滌液沖洗；每孔加50 μL細胞培養(yǎng)上清液，室溫孵育1 h，加入25 μL檢測抗體溶液，室溫下500 r·min-1振動濾板30 min；加入鏈霉親和素-PE，用Luminex 200儀器進行檢測。實驗獨立重復3次。

1.2.4 透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)取對數(shù)生長期的ARPE-19細胞，加入含有20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，分別于 1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后倒掉含A2E的培養(yǎng)液，將各組細胞用預冷的PBS洗2遍，用細胞刷刮下細胞，收集后2000 r·min-1離心10 min，棄上清，留細胞沉淀，同時用不含A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)的ARPE-19細胞作為對照；將4 ℃預冷的體積分數(shù)2.5%戊二醛固定液沿管壁緩慢加入沉淀的細胞中，4 ℃固定2 h后轉(zhuǎn)移到4 ℃ PBS中保存1～2 h，PBS漂洗3次；將樣品加入4 ℃預冷的鋨酸固定液中，4 ℃ 固定2 h，PBS漂洗3次，梯度酒精脫水；環(huán)氧樹脂浸透包埋樣品，超薄切片機切片；醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡下觀察細胞結(jié)構(gòu)并拍片。

1.2.5 免疫熒光染色檢測細胞中LC3的表達取對數(shù)生長期的ARPE-19細胞，以每孔40 000個接種于24孔板，孔板內(nèi)置入載玻片，常規(guī)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液；用含有20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h，同時用不含A2E的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng)的ARPE-19細胞作為對照。取出細胞爬片，用40 g·L-1多聚甲醛PBS固定15 min；體積分數(shù)0.1% Triton X-100穿透液滲透10 min；血清封閉液封閉30 min；滴加兔抗人LC3抗體(1100)4 ℃過夜；PBS洗3次，滴加小鼠抗兔熒光標記二抗(1200)，37 ℃避光反應2 h，PBS洗3次后熒光淬滅封片劑封片；暗室中熒光顯微鏡下選擇波長為490 nm觀察LC3綠色熒光斑點并計數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測Beclin-1和p62的表達取對數(shù)生長期的ARPE-19細胞常規(guī)培養(yǎng)至70%～80%融合時，用含有20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液分別培養(yǎng)1 h、3 h、6 h、12 h、24 h，同時用不含A2E的DMEM-F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)的ARPE-19細胞作為對照。將收獲的ARPE-19細胞溶解在RIPA緩沖液，12 000 r·min-1、4 ℃離心30 min去除細胞碎片，收集上清液，采用BCA法對蛋白樣品進行定量；SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜；用50 g·L-1脫脂牛奶封閉膜 1 h，配制適當濃度的一抗(Beclin-1抗體，11000；p62抗體，11000；β-actin抗體，11000)，將PVDF膜放入其中，并以50 r·min-1的速度搖晃1 h后4 ℃ 過夜；TBST洗滌緩沖液搖床上洗滌3次；15000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下孵育1 h。利用ImageJ軟件分析結(jié)果，實驗獨立重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 6進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示。多組間的比較采用完全隨機設計的單因素方差分析，兩組間的比較采用t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度A2E對ARPE-19細胞增殖的影響CCK-8法檢測ARPE-19細胞在不同時間點的增殖結(jié)果顯示，與對照相比，10 μmol·L-1的A2E分別作用ARPE-19細胞1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后細胞增殖無明顯變化；20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細胞6 h細胞活性開始下降，細胞增殖受到抑制，隨作用時間延長，細胞活性下降更明顯，與對照相比差異均有統(tǒng)計學意義(均為P< 0.05)；當A2E濃度達到30 μmol·L-1時，與對照相比，A2E作用3 h細胞增殖即受到明顯抑制(P<0.001)，提示該濃度對細胞具有較高的毒性作用(圖1)。因此本實驗選擇20 μmol·L-1的A2E進行后續(xù)研究。

圖1不同濃度A2E對ARPE-19細胞增殖能力的影響 與對照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.2 A2E對ARPE-19細胞分泌細胞因子的影響采用多重細胞因子檢測技術檢測20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細胞后各種細胞因子的表達變化結(jié)果顯示，ARPE-19細胞6 h起，細胞因子ICAM、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、Ang-2、IGF-1、TGF-β表達水平均有所升高，與未給予A2E處理的對照相比，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，細胞因子PIGF和VEGFA的表達水平在20 μmol·L-1A2E作用12 h后也明顯升高(均為P<0.01)(見圖2)。提示A2E能夠刺激ARPE-19細胞分泌多種AMD相關的炎癥因子、趨化因子和血管生長因子。

圖2 20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19細胞6 h、12 h后對各細胞因子的影響 與對照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 A2E對ARPE-19細胞超微結(jié)構(gòu)的影響利用透射電子顯微鏡觀察A2E能否誘導ARPE-19自噬的發(fā)生，結(jié)果顯示，最早從20 μmol·L-1的A2E作用1 h開始，ARPE-19細胞的細胞質(zhì)內(nèi)可以見到由雙層膜構(gòu)成的碗狀結(jié)構(gòu)即“吞噬泡”，尚未收口，這是自噬體開始形成的標志；在隨后的3 h、6 h，觀察到了典型的雙層膜自噬體結(jié)構(gòu)；A2E作用12 h和 24 h 時，可以看到溶酶體膜和自噬泡膜融合后形成的單層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體結(jié)構(gòu)；自噬溶酶體在A2E作用24 h時開始出現(xiàn)內(nèi)容物減少，體積逐漸縮小，提示自噬溶酶體的退化和降解(圖3)。至此，通過電子顯微鏡證實了A2E能夠激活ARPE-19細胞的自噬反應，并觀察到整個自噬潮發(fā)生的動態(tài)過程。

圖3 透射電子顯微鏡下觀察20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19細胞不同時間對細胞形態(tài)的影響 A：對照；B：作用1 h；C：作用3 h；D：作用6 h；E：作用12 h；F：作用24 h。

2.4 免疫熒光染色檢測A2E對ARPE-19細胞LC3表達的影響用濃度為20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細胞，通過熒光顯微鏡觀察LC3蛋白形成的綠色熒光斑點，結(jié)果顯示，與對照相比，20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細胞6 h起即可見細胞質(zhì)內(nèi)LC3熒光呈現(xiàn)點狀聚集，此時斑點數(shù)量較少，體積較小，彌散在細胞質(zhì)中，至12 h時熒光斑點數(shù)量達到最多，顆粒也最大，差異最明顯，24 h時綠色熒光斑點數(shù)量開始下降，熒光強度也較前減弱(圖4)，提示自噬溶酶體開始退化和降解，自噬活性逐漸減弱。

圖4 20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19細胞不同時間后LC3熒光顆粒的表達

2.5 Western blot檢測自噬相關蛋白的表達用濃度為20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細胞，Western blot檢測自噬相關蛋白Beclin-1和p62的表達，用以評價自噬的水平。結(jié)果顯示，與未給予A2E處理的對照相比，給予20 μmol·L-1A2E處理后1 h、3 h、6 h、12 h及24 h的ARPE-19細胞中Beclin-1蛋白的表達水平均顯著升高(均為P<0.01)，其中作用12 h時的蛋白表達量達到最高，這與上述LC3熒光斑點的表達變化相一致；與對照相比，20 μmol·L-1A2E處理后不同時間點ARPE-19細胞中p62蛋白的表達水平均顯著下降(均為P<0.05)(圖5)。

圖5 20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19細胞不同時間后自噬相關蛋白的表達 與對照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

AMD是目前影響老年人視力和生存質(zhì)量的主要眼科疾病之一，其發(fā)病機制尚不十分明確，仍缺乏有效的治療手段。近年來的研究表明，一種年齡相關的色素——脂褐素及其核心成分A2E在AMD的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，它們隨年齡增長而沉積于視網(wǎng)膜下，并可能通過慢性光化學作用損傷局部視網(wǎng)膜和脈絡膜，從而導致AMD的發(fā)生[9]。

脂褐素是一種脂質(zhì)或蛋白質(zhì)的聚合物，存在于不同組織有絲分裂后細胞的溶酶體內(nèi)。A2E作為脂褐素主要的載體成分，是視黃醛代謝后在RPE細胞內(nèi)沉積的產(chǎn)物，由于它難于降解，就以脂褐素的形式積聚在RPE細胞中[10]。一些學者對RPE細胞中各種溶酶體酶活性在A2E影響下的變化進行檢測；另一些學者在體外細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，脂褐質(zhì)大量聚集降低了RPE細胞的吞噬功能[11-13]。由于A2E對離體培養(yǎng)的ARPE細胞的損傷作用有時間和劑量累積效應，因此尋求合適的時間和劑量是進一步研究A2E在AMD發(fā)病中作用的關鍵。有研究報道，人眼內(nèi)RPE細胞中A2E的濃度水平為每105個細胞中 60～130 ng[14]或每眼中含830 pmol[15]，這相當于體外用濃度為15～30 μmol·L-1的A2E培養(yǎng)ARPE細胞數(shù)小時的水平[16]。本研究中當A2E濃度為20 μmol·L-1時，一方面對體外培養(yǎng)的ARPE-19細胞產(chǎn)生一定的損傷作用，另一方面與人眼中的A2E濃度最接近，能更好地模擬人眼內(nèi)RPE細胞的生理和病理情況，是理想的實驗觀察濃度。因此，我們選擇20 μmol·L-1的A2E進行后續(xù)實驗。

近年來，有學者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)A2E與AMD發(fā)病中的某些重要環(huán)節(jié)具有相關性。正常情況下，RPE細胞會產(chǎn)生大量免疫抑制因子(如IL-18、IL-37等)，防止過度免疫炎癥反應損傷眼內(nèi)組織[17]。當RPE細胞受損時，不能分泌足夠的抑制因子，眼內(nèi)免疫豁免穩(wěn)態(tài)喪失，眼內(nèi)長期處于慢性炎癥狀態(tài)，長期積累損傷導致了AMD的發(fā)生[18]。RPE細胞激活后將分泌大量促炎因子，誘發(fā)炎癥免疫反應的瀑布式激活。Anderson等[19]發(fā)現(xiàn)，A2E能夠刺激RPE細胞產(chǎn)生炎癥相關趨化因子和細胞因子，而包括NLRP3、Caspase-1和ASC在內(nèi)的炎癥小體參與了這一過程。Caspases作為炎癥小體的“反應器”，可以將無活性的炎癥因子的前體[主要為IL-1β前體(pro-IL-1β)和IL-18前體(pro-IL-18)]水解為有活性的成熟因子(如IL-1β、IL-18)，進而產(chǎn)生炎癥反應[20]。而 NLRP3炎癥小體激活，能夠使其信號通路下游炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-33以及 TNF-α等分泌增加[21]。RPE功能受損不僅會導致脈絡膜毛細血管代謝障礙、光感受器細胞死亡，而且誘發(fā)的局部炎癥反應可以促進新生血管生成[22]。Iriyama等[23]發(fā)現(xiàn)，在小鼠視網(wǎng)膜下注入A2E三周后能夠誘導RPE細胞死亡，并伴有RPE和脈絡膜內(nèi)VEGF表達水平的升高。本研究采用20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19細胞，選擇了10種與AMD發(fā)病密切相關的炎癥因子、趨化因子和血管生長相關因子(包括ICAM、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、Ang-2、PIGF、IGF-1、TGF-β及VEGFA)，檢測ARPE-19細胞培養(yǎng)上清液中各種細胞因子的變化，結(jié)果證實，A2E能夠刺激RPE細胞分泌多種炎癥相關細胞因子和血管生長相關因子，這為A2E與AMD發(fā)病機制中炎癥、新生血管之間的聯(lián)系提供了進一步的證據(jù)。

自噬是一種細胞內(nèi)成分自我降解的過程，包括自噬的誘導、自噬體膜的形成、自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合以及內(nèi)容物的降解[24]。自噬對細胞有著雙重作用，一方面它可以清除受損病變的細胞器及大分子物質(zhì)，或為饑餓條件下的細胞提供能量和底物；但持續(xù)而劇烈的自噬卻會導致自噬性細胞死亡，又稱為II型程序性細胞死亡[25]。本研究中，我們將A2E作用于ARPE-19細胞，結(jié)果顯示，ARPE-19細胞質(zhì)內(nèi)開始出現(xiàn)碗狀、尚未收口的雙層膜結(jié)構(gòu)的“吞噬泡”，隨著時間推移出現(xiàn)自噬體結(jié)構(gòu)以及自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，這些統(tǒng)稱為自噬囊泡。自噬囊泡在A2E作用24 h時開始出現(xiàn)內(nèi)容物減少，體積逐漸縮小，提示自噬溶酶體的退化和降解。至此，我們通過透射電子顯微鏡證實了A2E作用于RPE細胞能夠激活細胞的自噬反應，并觀察到整個自噬潮發(fā)生的動態(tài)過程。

自噬過程由自噬相關基因(Atg)調(diào)控，LC3(Atg8)是自噬體膜上的標記蛋白，LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成LC3-I，LC3-I散在分布于細胞質(zhì)內(nèi)。當自噬體形成后，LC3-II始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標記，且LC3-II的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[26-27]。自噬發(fā)生過程中，通過免疫熒光的方法檢測內(nèi)源性LC3熒光強度的變化即可以反映自噬活性，自噬誘導后的細胞表現(xiàn)為熒光斑點狀聚集增多。BECN1是酵母中自噬基因Atg6的同源物，是第一個被發(fā)現(xiàn)的自噬相關基因[28]。其編碼的Beclin-1蛋白可調(diào)控自噬前體的形成，引導其他的Atg蛋白在自噬體膜上的定位[29]。研究發(fā)現(xiàn)，過表達Beclin-1可以加強血清和氨基酸撤除誘導的自噬，說明Beclin-1是自噬重要的正調(diào)節(jié)因子[30]。Beclin-1-/-小鼠自噬缺陷，細胞凋亡卻正常，說明Beclin-1是自噬特異性的調(diào)控基因[31]。因此，通過Western blot檢測Beclin-1的表達水平，能夠?qū)毎淖允苫钚赃M行進一步的判斷。p62是一種自噬連接蛋白，Komatsu等[32]報道了p62和LC3之間的關聯(lián)，證實p62在自噬中的作用。研究表明，p62介導了自噬轉(zhuǎn)換的蛋白質(zhì)聚集物的形成，這表明p62通過自噬促進了蛋白質(zhì)的選擇性降解。因此，p62作為一個適配器，結(jié)合泛素化的蛋白質(zhì)聚集物，并將它們傳遞給自噬體[33]。本研究中，20 μmol·L-1A2E作用下的ARPE-19細胞中Beclin-1蛋白的表達明顯增加，p62蛋白的表達明顯下降，說明A2E能夠引起ARPE-19細胞自噬活性的增加，Beclin-1及p62蛋白可能參與了這一過程。

綜上所述，本研究證實了20 μmol·L-1的A2E能夠誘導ARPE-19細胞的自噬發(fā)生；該濃度的A2E同時能夠抑制ARPE-19細胞的增殖，并刺激多種AMD相關炎癥因子和新生血管因子的分泌。至于本研究中A2E引起的自噬激活在這一過程中究竟扮演了何種角色，還有待于后續(xù)進一步研究。