基于UHPLC-Q-Exactive質(zhì)譜法分析桔紅素在大鼠體內(nèi)的代謝過程

馬貝貝，婁天宇，梁耀月，王婷婷，李瑞吉，劉金輝，王晨曉，于尚玥，郭玉東，王 晶*，王志斌

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

2.北京市藥品檢驗所，北京 102200

3.同仁堂科技發(fā)展股份有限公司，北京 100071

桔紅素（tangeretin），又被稱為橘紅素、蜜桔素、桔皮素或5,6,7,8,4′-五甲氧基黃酮，作為一種天然的多甲氧基黃酮類化合物（polymethoxylated flavones，PMFs），主要存在于蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumLinn.和川橘C.nobilisLour.的果皮以及柑橘C.reticulataBlanco.的葉和莖中[1-3]。近年來國內(nèi)外研究表明，桔紅素具有較強(qiáng)的藥理活性，如可減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷、抑制氧化應(yīng)激和炎癥、保護(hù)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及抑制鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等[4-7]。此外，桔紅素還可抗腫瘤、抗癲癇以及阻斷病毒融合、治療拉沙病毒引起的病毒性出血熱，被廣泛應(yīng)用于食品保健和醫(yī)學(xué)研究[8-10]。然而有關(guān)桔紅素的體內(nèi)代謝研究卻鮮有報道，急需一種快速有效的分析方法詳細(xì)闡明桔紅素的代謝產(chǎn)物和代謝途徑[11-12]。

超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)（UHPLCHRMS）將色譜分離與質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析相結(jié)合，同時具備高選擇性、高靈敏度及高精準(zhǔn)度的獨特優(yōu)勢，使迅速分離成分與結(jié)構(gòu)信息獲取一體化，從而頻繁應(yīng)用于藥物成分檢測和快速篩查[13-16]。四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（Q-Exactive Orbitrap MS）將四極桿對母離子的高選擇性與提供準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)的高分辨Orbitrap技術(shù)相統(tǒng)一，檢出限度小，質(zhì)量偏差范圍窄，可顯著消除樣品基質(zhì)的干擾，實現(xiàn)對復(fù)雜樣品的定性和定量分析[17-20]。固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）是21世紀(jì)以來蓬勃興起的樣品前處理技術(shù)，可使分離、純化與濃縮同步完成，常被用于多甲氧基類黃酮等柑橘中的有效成分在動物體內(nèi)的代謝研究[21-23]。

因此，本研究采用SPE法提取生物樣品，純化后通過UHPLC-Q-Exactive MS技術(shù)分析桔紅素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，以期剖析其在動物體內(nèi)的代謝過程。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Fisher Ultimate 3000超高效液相色譜儀和Q-Exactive質(zhì)譜（美國Thermo Fisher公司），配有電噴霧離子源（ESI）；Xcalibur 2.1工作站；R200D分子天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）；Milli-Q Synthesis超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；OASIS HLB C18固相萃取小柱（3 L/60 g，美國Waters公司）。

1.2 試劑

桔紅素對照品（成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號MUST-18012910）；乙腈和甲醇（質(zhì)譜級，美國Thermo Fisher公司）；甲酸（色譜級，德國Merck公司）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠（雄性，200～220 g），購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0011。本研究由北京市藥品檢驗所實驗動物倫理委員會審查通過，實驗動物使用許可證號SYXK（京）2015-0033。

2 方法

2.1 供試品溶液的配制

稱取桔紅素對照品480 mg，溶解于16 mL 0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液中。

2.2 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫25 ℃；流動相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～1 min，5% B；1～3 min，5%～25% B；3～8 min，25%～60% B；8～15 min，60%～80% B；15～20 min，80%～100% B；20～24 min，100% B；24～25 min，100%～5% B；25～30 min，5% B；體積流量為0.30 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，毛細(xì)管溫度350 ℃，鞘氣（sheath gas）體積流量275 kPa，輔助氣（aux gas）體積流量138 kPa，噴霧電壓（source voltage）4 kV。碰撞能量（collision energy）40 eV。檢測方式為Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1500。

2.4 動物實驗

將16只SD大鼠隨機(jī)分為空白組與給藥組，實驗前于SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周（室溫22～26 ℃，濕度40%～70%，12 h晝夜更替），喂藥前禁食12 h，全程不禁水。

給藥組以300 mg/kg的劑量ig給予桔紅素溶液，空白組則ig等量的0.5%的羧甲基纖維素鈉。

2.5 生物樣品采集

待空白組與給藥組大鼠給藥完成后，置于代謝籠中，分別于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h眼內(nèi)眥取血約0.5 mL置于肝素鈉抗凝EP管中，靜置15 min，于4 ℃下3000 r/min離心15 min，合并上述5個時間點的上清液，將空白組與給藥組血漿分裝保存（-80 ℃）。分別收集其24 h內(nèi)排出的尿液與糞便，尿液于4 ℃下3000 r/min離心15 min，收集上清液分裝（-80 ℃）。糞便烘干后研磨粉碎，分別稱取2組糞便粉末各0.5 g，溶解于70%的乙醇中，超聲提取30 min，收集溶液層保存（-80 ℃）。

2.6 SPE處理生物樣品

將固相萃取小柱用5 mL甲醇與5 mL去離子水活化平衡，分別取解凍后的生物樣品（血漿、尿液與糞便）各1 mL加入柱中，依次用5 mL去離子水和3 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，室溫下用氮氣吹干，得到的殘渣用100 μL初始比例流動相（5%乙腈溶液）復(fù)溶，渦旋震蕩3 min，13 000 r/min離心15 min（4 ℃），收集上清液進(jìn)行UHPLC- HRMS分析。

3 結(jié)果

3.1 桔紅素對照品的質(zhì)譜裂解行為分析

在正離子掃描模式下，桔紅素產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰m/z373.127 62，分子式為C20H21O7（誤差為-1.50 ×10-6）。在其ESI-MS2質(zhì)譜圖中，檢測到的主要二級碎片離子有m/z358 [M－CH3]+、m/z343 [M－2CH3]+、m/z312 [M－2CH3－OCH3]+、m/z327 [MCH3－OCH3]+、m/z297 [M－3CH3－OCH3]+以及m/z345 [M－CO]+。通過對比黃酮類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律[24-25]，本研究以連續(xù)丟失CH3與OCH3、中性丟失CO作為此類化合物的在ESI正離子模式下的特異性裂解規(guī)律，以為下一步的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)篩選與鑒定提供依據(jù)。桔紅素在正離子模式下的多級質(zhì)譜圖見圖1，其詳細(xì)裂解途徑見圖2。

圖1 桔紅素在正離子掃描模式下的多級質(zhì)譜圖Fig.1 Multi-level mass spectrum of tangeretin in positive ion scanning mode

圖2 桔紅素對照品在正離子模式下的裂解途徑Figure 2 Cleavage pathway of tangeretin in positive ion mode

3.2 大鼠體內(nèi)桔紅素的代謝產(chǎn)物分析與鑒定

基于UHPLC-Q-Exactive高分辨質(zhì)譜技術(shù)分析大鼠給藥后的尿液、血漿與糞便，通過對比空白組與給藥組的生物樣品色譜圖，結(jié)合桔紅素對照品的質(zhì)譜碎裂規(guī)律、二級質(zhì)譜裂解碎片、保留時間、精確相對分子質(zhì)量以及脂水分配系數(shù)（calculated logP，ClogP），最終鑒定出包括原型在內(nèi)的28個代謝產(chǎn)物，其中尿液中有18個、血漿中有22個、糞便中有26個。鑒定結(jié)果見表1?？瞻捉M與給藥組的血漿、尿液與糞便的總離子流圖見圖3。

圖3 大鼠生物樣品的總離子流圖譜Fig.3 Total ion chromatograms of biological samples from rats

表1 大鼠尿液、血漿和糞便中的代謝產(chǎn)物Table 1 Summary of tangeretin metabolites in rat urine, plasma and feces

在正離子掃描模式下，代謝產(chǎn)物M0的色譜保留時間為9.71 min，精確相對分子質(zhì)量為373.127 66，其質(zhì)譜碎裂行為與桔紅素對照品類似，結(jié)合文獻(xiàn)報道[26-27]，可將其準(zhǔn)確鑒定為桔紅素。化合物M13、M19、M23以及M24在正離子模式下均產(chǎn)生m/z為359.112 48的準(zhǔn)分子離子峰，較之桔紅素少14（丟失了1分子CH2），由精確相對分子質(zhì)量推測出它們的分子式都為C19H19O7，在ESI-MS2裂解過程中，它們都產(chǎn)生了m/z344（脫去1分子CH3）、m/z329（脫去2分子CH3）以及m/z311（脫去1分子H2O）的碎片離子，據(jù)此推斷它們都是桔紅素的去甲基化產(chǎn)物。根據(jù)反相色譜的洗脫行為，ClogP值越大的化合物越難被洗脫。因此代謝產(chǎn)物M13、M19、M23和M24分別為5,6,7,8-四甲氧基-4′-羥基黃酮（ClogP，1.80），5,6,7,4′-四甲氧基-8-羥基黃酮（ClogP，2.13），5,6,8,4′-四甲氧基-7-羥基黃酮或5,7,8,4′-四甲氧基-6-羥基黃酮（ClogP，2.23），6,7,8,4′-四甲氧基-5-羥基黃酮（ClogP，3.03）。

代謝產(chǎn)物M11、M18和M27均產(chǎn)生m/z375.107 43的準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+，推測分子式為C19H19O8，其相對分子質(zhì)量比M13、M19、M23以及M24多16，推測為它們的羥基化產(chǎn)物。在它們的二級質(zhì)譜圖中都存在m/z345（丟失2分子CH3）、m/z327（失去1分子H2O）和m/z299（中性丟失1分子CO）等離子碎片，因此M11、M18和M27為桔紅素發(fā)生去甲基化反應(yīng)后的羥基化產(chǎn)物。

化合物M8在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z535.144 63，推測分子式為C25H27O13，其相對分子質(zhì)量比M13多176，推測為M13、M19、M23以及M24的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。在其ESI-MS2裂解過程中檢測到m/z359（丟失1分子葡萄糖醛酸）以及m/z344、329、311等碎片離子，進(jìn)一步證明其與M13的碎裂行為相似，因此可將M8鑒定為桔紅素去甲基化和葡萄糖醛酸化復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)物。同理，M6的相對分子質(zhì)量551.139 54比M11、M18及M27多176，二級質(zhì)譜圖中m/z375是由m/z551中性丟失1分子葡萄糖醛酸產(chǎn)生的，又根據(jù)m/z360、345、327等特征碎片將M6鑒定為桔紅素去甲基化、羥基化和葡萄糖醛酸化復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)物。

代謝產(chǎn)物M16的準(zhǔn)分子離子峰為m/z439.069 33[M＋H]+，推測分子式為C19H19O10S（誤差為-1.47×10-6），比去甲基化桔紅素的理論相對分子質(zhì)量多80，推測為桔紅素去甲基化和硫酸酯化反應(yīng)產(chǎn)物。而之后連續(xù)丟失CH3以及中性丟失1分子水（分別產(chǎn)生m/z344, 329, 311）進(jìn)一步證實了上述推斷。與之相似，化合物M12（C19H19O11S）被鑒定為桔紅素去甲基化、羥基化和硫酸酯化產(chǎn)物。

化合物M1、M3、M9、M15、M17和M25均產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰m/z345.096 98 [M＋H]+，推測其分子式為C18H17O7，分子質(zhì)量比桔紅素少28，推測為桔紅素雙去甲基化產(chǎn)物。在二級裂解過程中檢測到m/z345、315、330等特征碎片，證明它們的裂解規(guī)律與桔紅素類成分一致[28-29]，故將它們鑒定為桔紅素雙去甲基化反應(yīng)產(chǎn)物（失去了2分子CH2）。而代謝物M5、M7及M22均產(chǎn)生m/z361.091 88的準(zhǔn)分子離子峰，由Xcalibur推測分子式為C18H17O8，相對分子質(zhì)量較M1多16，推測為M1類同分異構(gòu)體的羥基化產(chǎn)物。在ESI-MS2質(zhì)譜碎裂中，m/z361、346、331、328及300等特征離子表明其裂解行為與M1等化合物類似，因此將M5、M7及M22鑒定為桔紅素雙去甲基化和羥基化產(chǎn)物。

在正離子掃描模式下，代謝產(chǎn)物M4產(chǎn)生m/z331.081 38，分子式為C17H15O7的準(zhǔn)分子離子峰（誤差為-1.63×10-6）。其實驗相對分子質(zhì)量較之桔紅素少42，推測是由桔紅素發(fā)生三去甲基化反應(yīng)生成的。M4主要的二級碎片離子m/z316和m/z301分別是由m/z331連續(xù)丟失CH3基團(tuán)所產(chǎn)生，而m/z298進(jìn)一步反映其裂解行為與化合物M1、M13等相似，故將M4鑒定為桔紅素三去甲基化產(chǎn)物。與M5、M11的鑒定方式相同，可將分子式為C17H15O8的M2和M14鑒定為桔紅素三去甲基化與羥基化復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)物。

化合物M20和M21的準(zhǔn)分子離子峰均為m/z389.123 08 [M＋H]+，推測分子式為C20H21O8，比正離子模式下檢測到的桔紅素（C20H21O7）多了1個氧原子，推測為桔紅素發(fā)生了羥基化反應(yīng)。在其二級質(zhì)譜圖中篩選得到的m/z374、359、341和313等離子碎片進(jìn)一步證實了上述推斷。代謝產(chǎn)物M26產(chǎn)生了m/z403.138 68和分子式為C21H23O8的準(zhǔn)分子離子峰（誤差為-2.37×10-6）。其相對分子質(zhì)量比桔紅素多30，推測桔紅素結(jié)構(gòu)中多了1個甲氧基（-OCH3）。在ESI-MS2質(zhì)譜圖中，m/z403經(jīng)碰撞誘導(dǎo)碎裂產(chǎn)生m/z388、373（連續(xù)丟失CH3）、m/z355（脫去1分子H2O）、m/z327（中性丟失CO），故將M26鑒定為桔紅素甲氧基化產(chǎn)物。其二級譜圖見圖4。

圖4 代謝物M26的二級質(zhì)譜圖Fig.4 Secondary mass spectrum of metabolite M26

代謝物M10在6.82 min被洗脫并產(chǎn)生m/z315.122 68的準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+，預(yù)測分子式為C18H19O5（誤差為-2.00×10-6）。其相對分子質(zhì)量比桔紅素少58，而二級譜圖中的特征碎片m/z133表明中性丟失了1分子CO，m/z297、279等產(chǎn)物離子證明其碎裂行為與桔紅素類化合物相同，故推測桔紅素還脫去了1分子甲氧基（-OCH3）。因此將M10鑒定為桔紅素去甲氧基化和脫一氧化碳復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)物。其二級譜圖見圖5。

圖5 代謝物M10的二級質(zhì)譜圖Fig.5 Secondary mass spectrum of metabolite M10

3.3 桔紅素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑分析

通過對比空白組大鼠的血漿、尿液與糞便質(zhì)譜圖，最終從給藥組大鼠的生物樣品中鑒定出28個代謝產(chǎn)物，其詳細(xì)代謝途徑見圖6。綜合分析這些代謝物的轉(zhuǎn)化途徑，桔紅素在大鼠體內(nèi)主要發(fā)生去甲基化、羥基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸化、去甲氧基化、甲氧基化、脫一氧化碳以及它們的復(fù)合反應(yīng)等。

圖6 桔紅素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathway of tangeretin in rats

4 結(jié)論

本研究采用固相萃取法處理大鼠的生物樣品（尿液、血漿與糞便），可高效提取其中的代謝產(chǎn)物，使有機(jī)溶劑的使用量大大減少、重復(fù)性得到進(jìn)一步優(yōu)化，且操作簡便，避免了多種雜質(zhì)的干擾。生物樣品經(jīng)純化后，使用UHPLC-Q-Exactive高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對大鼠體內(nèi)桔紅素的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了全面篩選與快速鑒定，基于桔紅素等多甲氧基類黃酮對照品的特征性碎裂行為、通過化合物的精確相對分子質(zhì)量獲取分子式，使誤差縮小，鑒定結(jié)果更為精確。

結(jié)果表明，共從給藥組大鼠的生物樣品中鑒定出28個代謝產(chǎn)物。其中鑒定得到的M1、M3、M4及M13等代謝物最為常見，而其后發(fā)生羥基化反應(yīng)生成的M2、M5與M11，發(fā)生硫酸酯化和葡萄糖醛酸化反應(yīng)生成的M6、M8和M12進(jìn)一步剖析了桔紅素深層次的代謝輪廓。而M10（脫甲氧基與一氧化碳）與M26（甲氧基化）則對現(xiàn)有極少數(shù)有關(guān)桔紅素的代謝研究作了重要補(bǔ)充。本研究較為詳細(xì)地剖析了桔紅素這一類多甲氧基黃酮的代謝機(jī)制和中間過程，可為桔紅素下一步的藥理活性、藥動學(xué)、毒理學(xué)研究及食品保健藥物的開發(fā)提供參考，同時可為其他中藥天然有效成分的代謝研究提供借鑒。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突