杜映雪,李 靜,陳孫妮,李 娟,鄧澤元
肥胖作為全球性的健康問(wèn)題,其發(fā)生會(huì)增加糖尿病、高血壓和冠心病等疾病的發(fā)病率[1]。運(yùn)動(dòng)不足、飲食結(jié)構(gòu)不合理、激素分泌異常、遺傳等許多因素可導(dǎo)致肥胖,而高脂飲食伴隨的過(guò)量卡路里攝入是導(dǎo)致肥胖發(fā)生的首要因素。治療肥胖的首選為調(diào)整飲食結(jié)構(gòu),控制飲食中的脂肪總量[2]。然而,脂肪為機(jī)體提供必需脂肪酸、脂溶性維生素和能量,過(guò)分降低膳食中脂肪量不可取。尋找符合營(yíng)養(yǎng)需求同時(shí)具有減重功效的產(chǎn)品,對(duì)于改善機(jī)體脂代謝,預(yù)防一系列并發(fā)癥尤其是心血管疾病的發(fā)生以及促進(jìn)人類(lèi)健康具有重大意義。為此,可從膳食脂肪的結(jié)構(gòu)出發(fā),尋找膳食脂肪的替代品。中長(zhǎng)鏈甘油三酯(medium and long-chain triacylglycerols,MLCT)是一種由天然油脂通過(guò)改性或結(jié)構(gòu)重組得到的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(structured lipid,SL),其在一個(gè)甘油三酯分子上同時(shí)結(jié)合有中鏈脂肪酸(medium chain fatty acid,MCFA) 和長(zhǎng)鏈脂肪酸(long chain fatty acid,LCFA)[3]。研究表明,MCFA與LCFA 的生理代謝途徑有著明顯差異:MCFA有較短的碳鏈,在體內(nèi)吸收代謝速率快,可直接通過(guò)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟氧化供能;而LCFA 的碳鏈較長(zhǎng),在體內(nèi)代謝效率低,極易形成新的甘油三酯并貯藏在脂肪或肝臟等組織中[4]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),MLCT 能加快脂質(zhì)在體內(nèi)的代謝速率,降低血脂、弱化脂蛋白代謝,減少脂肪蓄積[5-7];可快速為機(jī)體供能[8],有助于提高免疫力,降低炎癥反應(yīng),預(yù)防2型糖尿病以及降低癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。MLCT 既保留了天然油脂的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,又在其基礎(chǔ)上降低油脂的熱量,在食品和醫(yī)藥方面都有著廣泛應(yīng)用[11]。MLCT 有可能代替?zhèn)鹘y(tǒng)食用油脂,成為一種理想的功能型食用油。MLCT 對(duì)于機(jī)體的減脂作用已有研究,而MLCT 是否對(duì)于肝臟的脂質(zhì)代謝有快速且明顯的改善作用,國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以SD 大鼠為研究對(duì)象,對(duì)其給予由高油酸菜籽油(high oleic rapeseed oil,HORO)和中鏈甘油三酯(medium-chain triacylglycerols,MCT)通過(guò)酯交換反應(yīng)合成的中長(zhǎng)鏈甘油三酯,并通過(guò)與HORO 和MCT 的對(duì)比,探究短期內(nèi)含有MLCT 的飲食對(duì)于動(dòng)物肝臟脂肪酸組成和脂質(zhì)代謝的影響,從而驗(yàn)證MLCT 對(duì)脂質(zhì)代謝改善和肥胖預(yù)防的功效。
SPF 級(jí)雄性SD 大鼠,初始體重為(100±10)g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(SCXK(湘)2016-0002)。
中長(zhǎng)鏈甘油三酯(MLCT)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室方法[12]合成,所得產(chǎn)品油中MLCT 含量為71.1%;高油酸菜籽油(HORO),秦皇島金海特種食用油工業(yè)有限公司;中鏈甘油三酯油(MCT),DUBOIS-NATURAL ESTERS SDN.BHD.公司;3 種油脂的脂肪酸組成見(jiàn)表1??偟鞍锥繙y(cè)定試劑盒、甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒、總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoproteincholesterol,HDL-C)測(cè)定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterd,LDLC)測(cè)定試劑盒、載脂蛋白A1(apolipoprotein A1,Apo A1)測(cè)試盒、載脂蛋白B(apolipoprotein B,Apo B)測(cè)試盒、激素敏感脂肪酶(HSL)試劑盒、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)測(cè)試盒、蛋白激酶A(PKA)試劑盒、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)試劑盒,南京建成生物工程研究所;普通大鼠全價(jià)混合飼料,南昌大學(xué)動(dòng)物科學(xué)部;GLC-463 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)NU-CHEK-PREP 公司;正己烷(色譜純),德國(guó)Meker 公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
表1 3 種脂質(zhì)的脂肪酸組成Table 1 Fatty acid compositions of the three lipids
MK3 型多功能酶標(biāo)儀,芬蘭Thermo 公司;6890N 型氣相色譜儀,美國(guó)Agilent 公司;AR1140電子分析天平,美國(guó)奧豪斯貿(mào)易公司;HH-S11 型電熱恒溫水浴鍋,北京醫(yī)用離心機(jī)廠;TDL-40B 型臺(tái)式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;WH-866 渦旋混合器,太倉(cāng)市科教器材廠;DSY-III 氮吹儀,北京金科精華苑科技有限公司;LGR-10 型冷凍離心機(jī),鄭州博科儀器有限公司;F6/10 超細(xì)勻漿機(jī),廣州深華公司,CNWBOND NH2氨基SPE 小柱,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司。
1.2.1 動(dòng)物飼喂及分組 32 只雄性SD 大鼠飼養(yǎng)于南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房。大鼠飼養(yǎng)溫度控制在25 ℃左右,光照、黑暗時(shí)間為12 h,環(huán)境濕度為60%,所有實(shí)驗(yàn)大鼠均自由攝食基礎(chǔ)飼料和水?;A(chǔ)飼料的營(yíng)養(yǎng)組成見(jiàn)表2。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,稱(chēng)量大鼠空腹體重,并隨機(jī)分成4組,每組8 只:1)空白對(duì)照組(Control 組):每日以1 g/100 g 體重的劑量灌胃生理鹽水;2) 中長(zhǎng)鏈甘油三酯組(MLCT 組):每日以1 g/100 g 體重的劑量灌胃MLCT;3)中鏈甘油三酯組(MCT 組):每日以1 g/100 g 體重的劑量灌胃MCT;4)高油酸菜籽油組(HORO 組):每日以1 g/100 g 體重的劑量灌胃HORO。所有大鼠的喂養(yǎng)時(shí)間為2 周。
表2 基礎(chǔ)飼料的營(yíng)養(yǎng)組成Table 2 Nutritional compositions of the basic diet
1.2.2 樣本處理 喂養(yǎng)結(jié)束后,禁食12 h,稱(chēng)量各組大鼠體重;乙醚麻醉,眼眶采血于含EDTA 的抗凝管中,室溫下靜止30 min,2 500 r/min 離心10 min,收集上層透明液體即為血漿,-80 ℃保存以備用。大鼠解剖后,取肝臟組織,用生理鹽水清洗后稱(chēng)重,保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 血漿中指標(biāo)的測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定血漿中TG、TC、HDL-C、LDL-C 含量,并計(jì)算HDL-C/LDL-C 比值。
1.2.4 肝臟中脂代謝指標(biāo)的測(cè)定 稱(chēng)取大鼠肝臟,按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9 的比例加入生理鹽水,冰水浴條件下機(jī)械勻漿1 min,2 500 r/min離心10 min,取上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TG、TC、總蛋白含量;按照ELISA 試劑盒測(cè)定方法測(cè)定大鼠肝臟中Apo A1、Apo B 的濃度以及脂質(zhì)代謝相關(guān)酶ATGL、HSL、PKA、cAMP 的表達(dá)水平。
1.2.5 肝臟中甘油三酯、磷脂脂肪酸組成的測(cè)定首先對(duì)肝臟內(nèi)的總脂肪采用Folch 法進(jìn)行提取[13],后用丙基硅膠固相萃取小柱分離出總脂肪中的TG、PL,方法如下:取2 mg 脂質(zhì)樣品,將其溶解于0.5 mL 氯仿溶液中。以6 mL 正己烷溶液活化固相萃取小柱,加入樣品,首先以4 mL 氯仿-異丙醇(2∶1,V/V)溶液洗脫,收集洗脫液為中性脂質(zhì),再以4 mL 乙酸-乙醚(2∶98,V/V)溶液洗脫,除去游離脂肪酸,最后以4 mL 甲醇溶液洗脫,收集洗脫液為磷脂,氮?dú)獯蹈?。中性脂質(zhì)用氮?dú)獯蹈珊螅尤?.2 mL 正己烷溶液溶解,另取一根固相萃取小柱,以正己烷溶液活化后,首先以正己烷溶液洗脫,除去膽固醇酯,再以6 mL 乙醚-二氯甲烷-正己烷(1∶10∶89,V/V)溶液洗脫,收集洗脫液為甘油三酯,并用氮?dú)獯蹈伞?/p>
將收集到的甘油三酯、磷脂分別溶解于1.5 mL 正己烷溶液后,進(jìn)行堿法甲酯化[14]。氣相色譜法測(cè)定兩者的脂肪酸組成。氣相色譜法條件:CPSil 88 熔融石英毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm,美國(guó)Agilent 公司)。載氣為氫氣,燃燒氣為氫氣、氮?dú)夂涂諝?。FID 溫度為250 ℃,進(jìn)樣口溫度為250 ℃。升溫程序:45 ℃保持4 min,以13 ℃/min的速率升至175 ℃,保持27 min,再以4 ℃/min 升至215 ℃,保持35 min;進(jìn)樣量:0.3 μL,不分流。脂肪酸的百分含量采用面積歸一化法確定(以峰面積的百分比表示)。
大鼠體重及肝臟質(zhì)量見(jiàn)表3。由表3可知,各組大鼠的攝食量、初始體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí),各組間大鼠的最終體重、體重增加量與增長(zhǎng)率雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但是在4 個(gè)組中,對(duì)照組大鼠有最小的體重增長(zhǎng)率(57.70%),其次為MCT 和MLCT 組,體重增長(zhǎng)率分別為(59.35±5.56)%和(62.82±6.25)%,HORO 組有最大的體重增長(zhǎng)率(63.55±3.53)%。說(shuō)明MCT和MLCT 具有降低大鼠體重的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,只有HORO 組大鼠的肝臟質(zhì)量有顯著性升高(P<0.05),且顯著性高于MLCT 和MCT 組(P<0.05)。
表3 攝食不同脂質(zhì)對(duì)SD 大鼠體重及肝臟質(zhì)量的影響(n=8)Table 3 Effects of feeding different lipids on body weight and liver weight of SD rats(n=8)
大鼠血脂的變化見(jiàn)表4。由表可知,MLCT 組大鼠血漿中TG、TC 濃度為各試驗(yàn)組中最低,而HORO 組具有最高的TG、TC 濃度,兩組間有顯著差異(P<0.05)。4 組動(dòng)物血漿中HDL-C 含量無(wú)顯著差異,但HORO 組HDL-C 的濃度最低。與對(duì)照組相比,3 個(gè)試驗(yàn)組的大鼠血漿中LDL-C 含量均有一定程度升高,其中,HORO 組LDL-C 含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。3 種脂質(zhì)的攝入均顯著降低了HDL-C/LDL-C 比值(P<0.05),其中,HORO組的HDL-C/LDL-C 比值最低,為2.73±0.85。
表4 攝食不同脂質(zhì)對(duì)SD 大鼠血漿中各指標(biāo)的影響(n=8)Table 4 Effects of feeding different lipids on indexes in plasma of SD rats(n=8)
大鼠肝臟中脂代謝指標(biāo)見(jiàn)表5。由表5可知,與對(duì)照組和HORO 組相比,MLCT 和MCT 組SD大鼠肝臟中TC 含量均有顯著性降低(P<0.05);TG 含量雖有降低的趨勢(shì),但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
表5 攝食不同脂質(zhì)對(duì)SD 大鼠肝臟中脂代謝指標(biāo)的影響(n=8)Table 5 Effects of feeding different lipids on indexes of lipid metabolism in livers of SD rats(n=8)
MLCT 和MCT 組大鼠肝臟中的Apo A1 含量均顯著性高于HORO 組(P<0.05),但與對(duì)照組無(wú)顯著差異。MLCT 和MCT 也升高了Apo B 含量,特別是MLCT 組Apo B 含量顯著高于HORO 組和對(duì)照組(P<0.05)。計(jì)算各組Apo A1/Apo B 比值可以發(fā)現(xiàn),MLCT 和MCT 組的Apo A1/Apo B 比值顯著高于HORO 組(P<0.05)。
各組大鼠肝臟中甘油三酯(TG)脂肪酸變化如表6所示。與對(duì)照組和MCT 組相比,MLCT 組和HORO 組的6c/9c-C18:1、9c12c-C18:2和C18:3n-3相 對(duì)含量都有顯著性升高(P<0.05),導(dǎo)致這兩組的不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,USFA)含量和單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)都顯著升高(P<0.05)。同時(shí),MLCT 組和MCT組C8:0和C10:0相對(duì)含量顯著高于對(duì)照組和HORO組(P<0.05)。
表6 SD 大鼠肝臟中甘油三酯脂肪酸組成(n=8)Table 6 Fatty acid compositions of triacylglycerols in livers of SD rats(n=8)
表7所示為各組大鼠肝臟中磷脂(PL)脂肪酸組成。可以看出,4 組大鼠肝臟磷脂中均未檢測(cè)出C8:0、C10:0。相比對(duì)照組,HORO 和MLCT 組6c/9c-C18:1、9c12c-C18:2相對(duì)含量均有顯著上升(P<0.05);而3 個(gè)試驗(yàn)組中C20:4n-6(Arachidonic acid,ARA)和C22:6n-3(Docosahexaenoic acid,DHA)的相對(duì)含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),且MCT 組的ARA 相對(duì)含量明顯高于HORO 組和MLCT 組(P<0.05)。HORO 組和MLCT 組的USFA 和MUFA 相對(duì)含量顯著性高于對(duì)照組和MCT 組(P<0.05)。且3 個(gè)試驗(yàn)組的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)相對(duì)含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
表7 SD 大鼠肝臟中磷脂脂肪酸組成(n=8)Table 7 Fatty acid compositions of phospholipids in livers of SD rats(n=8)
(續(xù)表7)
如表8所示,MCT 組大鼠肝臟中脂肪動(dòng)員相關(guān)酶HSL、PKA 和cAMP 水平均為4 組中最高,而ATGL 水平為各組中最低,且顯著低于HORO 組(P<0.05)。相反,在4 組中,HORO 組大鼠肝臟中HSL、cAMP 和PKA 水平均為最低,ATGL 水平在各組中為最高,且顯著高于MCT 組(P<0.05)。MLCT 組 的HSL、PKA 和cAMP 水 平 均 高 于HORO 組水平,低于MCT 組水平;而MLCT 組的ATGL 水平高于MCT 組,但低于HORO 組。同時(shí),MLCT 組的4 種脂質(zhì)代謝相關(guān)酶水平均高于對(duì)照組。
表8 攝食不同脂質(zhì)對(duì)SD 大鼠肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的影響(n=8)Table 8 Effects of feeding different lipids on lipid metabolism related enzymes in livers of SD rats(n=8)
本研究結(jié)果顯示,相比HORO 組,MLCT 組的SD 大鼠有著更小的體重增長(zhǎng)率,說(shuō)明MLCT 有抑制動(dòng)物體重增長(zhǎng)的趨勢(shì)。以往的研究表明,MCFA比LCFA 更能增加機(jī)體能量消耗,從而更好地抑制體重增長(zhǎng)、減少體內(nèi)脂肪聚集[15-16],與本研究結(jié)果基本一致。
機(jī)體脂代謝紊亂的最直觀表現(xiàn)為血脂代謝指標(biāo)上。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MLCT 相較于HORO 有效抑制了血漿中TG、TC 及LDL-C 含量的升高,升高了HDL-C/LDL-C 比值。研究表明MCFA 在體內(nèi)的利用效率顯著高于LCFA,且不易在血中聚集,使血液中甘油三酯濃度維持在較低水平[17]。HORO 主要由LCFA 組成,而MLCT 中含有一定比例的辛酸(C8:0)和癸酸(C10:0),這導(dǎo)致了兩者吸收代謝速率的差異。臨床研究發(fā)現(xiàn),血漿中TC、TG、LDL-C升高、HDL-C 降低會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[18]。而MCFA 在防治代謝綜合征方面具有良好的效果[19]。且同為飽和脂肪酸,MCFA 在維持機(jī)體膽固醇穩(wěn)態(tài)方面優(yōu)于LCFA。Xue 等[20]發(fā)現(xiàn),MLCT 可降低高甘油三酯血癥患者體重以及血清TG、LDLC,升高HDL-C,均表明MLCT 在改善血脂與預(yù)防肥胖相關(guān)疾病方面起到良好的作用。血液中脂代謝指標(biāo)水平的高低也與脂質(zhì)代謝的主要場(chǎng)所——肝臟密切相關(guān)[21]。血漿中脂質(zhì)的變化通常預(yù)示著肝臟脂肪的代謝變化。在肝臟中,Apo A1、Apo B分別是高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的主要載脂蛋白。Apo A1 有著調(diào)節(jié)脂代謝酶活性、促進(jìn)脂類(lèi)和膽固醇運(yùn)輸分解等作用,維持血脂水平正常,是肝硬化的重要指標(biāo)[22-23];Apo B 則與炎癥反應(yīng)和斑塊形成有關(guān)。Apo A 水平下降、Apo B 水平升高是引發(fā)冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的危險(xiǎn)因素[24];一些研究提示,Apo A1/Apo B 比值在預(yù)測(cè)疾病風(fēng)險(xiǎn)方面比單個(gè)血脂指標(biāo)更有價(jià)值[25-26],Apo A1/Apo B 比值升高與心肌梗塞、Ⅱ型糖尿病及代謝綜合征等疾病的發(fā)生均有關(guān)[27-29]。本研究結(jié)果顯示,相比HORO,攝入MLCT 使肝臟中TC 含量顯著減少,ApoA1 表達(dá)量顯著升高,且Apo A1/Apo B 比值顯著高于HORO 組,說(shuō)明MLCT 不僅改善血脂,還減少了肝臟脂質(zhì)的積累,加快肝臟組織對(duì)于多余脂質(zhì)的清除,證明了MLCT 對(duì)動(dòng)物脂代謝紊亂的改善作用穩(wěn)定有效,具有預(yù)防肝臟和心血管損傷的潛力。
肝臟作為機(jī)體能量代謝與轉(zhuǎn)換的重要器官,肝臟脂質(zhì)的過(guò)量沉積會(huì)引起肝細(xì)胞功能紊亂,進(jìn)而促進(jìn)脂肪肝的形成,危害機(jī)體健康。因此,檢測(cè)了肝臟中脂肪酸的組成變化。結(jié)果顯示,相比對(duì)照組,MLCT 組大鼠的肝臟質(zhì)量無(wú)明顯增加,且MLCT 使肝臟中不飽和脂肪酸相對(duì)含量顯著增加,有利于為機(jī)體提供必需脂肪酸,維持正常的生理代謝。必需脂肪酸是磷脂的重要組成部分[30],也是合成多種類(lèi)二十烷酸的前體物質(zhì)[31]。Carlson 等[32]研究發(fā)現(xiàn),在食用油中添加一定比例的MCT 在改善機(jī)體炎癥反應(yīng)的同時(shí),不會(huì)降低肝臟中必需脂肪酸的含量。肝臟中脂質(zhì)的積累與組成的改變也與脂質(zhì)代謝相關(guān)酶水平息息相關(guān)。本研究證實(shí)MLCT 可上調(diào)大鼠肝臟中cAMP、PKA、ATGL 和HSL 水平。MLCT 組大鼠肝臟中TG、TC 含量的降低,可能與這些脂質(zhì)動(dòng)員相關(guān)酶的大量表達(dá)有關(guān)。HSL 廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)的各個(gè)組織,其通過(guò)水解甘油三酯、產(chǎn)生游離脂肪酸為機(jī)體提供能量,在脂肪代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,與預(yù)防肥胖及胰島素抵抗等有密切關(guān)聯(lián)[33-34]。研究發(fā)現(xiàn),ATGL也是甘油三酯水解第一步的關(guān)鍵限速酶。體外試驗(yàn)顯示,當(dāng)ATGL 的表達(dá)受到抑制時(shí),機(jī)體組織中甘油三酯的分解顯著減少,證明該酶在脂質(zhì)代謝中的重要作用[35]。HSL 需要通過(guò)依賴(lài)cAMP 激活的PKA 磷酸化來(lái)獲得更強(qiáng)的分解甘油三酯的能力,而ATGL 不依賴(lài)于激活的PKA[36]。試驗(yàn)結(jié)果表明,相較于HORO,含MCFA 的MLCT 可能主要通過(guò)cAMP-PKA 途徑發(fā)揮作用。MLCT 在小腸中消化后,水解產(chǎn)生的MCFA 促進(jìn)cAMP 的合成,刺激PKA 的表達(dá)量增加,從而促進(jìn)HSL 的磷酸化。MLCT 可能在HSL 與ATGL 的雙重作用下促進(jìn)肝臟內(nèi)脂肪水解。因此,本研究推測(cè)MLCT 促進(jìn)脂質(zhì)代謝的機(jī)制之一可能為MLCT 通過(guò)升高肝臟組織中脂肪動(dòng)員相關(guān)酶水平來(lái)增加脂肪分解。
綜上所述,含有MLCT 的飲食對(duì)預(yù)防動(dòng)物肥胖、降低體脂與血脂具有積極作用。同時(shí),MLCT還有助于控制肝臟脂肪增加,改善肝臟脂質(zhì)代謝的作用。MLCT 有望作為新型的功能性食用油,用于預(yù)防肥胖和代謝紊亂。