水中微量金屬離子對(duì)大豆蛋白凝膠特性的影響

王睿智，高若珊，朱秀清，范洪臣，劉琳琳，石彥國

大豆蛋白營養(yǎng)豐富，價(jià)格低廉，易于制取，在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，常作為食品的原料及輔料。大豆蛋白由10%的清蛋白和90%的球蛋白組成，其中球蛋白是主要的貯藏蛋白。根據(jù)沉降系數(shù)的不同，可將大豆蛋白分為4 個(gè)組分：2S（15%）、7S（34%）、11S（41.9%）、15S（9.1%）[1]。

大豆蛋白具有在加熱條件下形成凝膠的能力。這種能力以及大豆蛋白凝膠自身的物理性質(zhì)，對(duì)傳統(tǒng)食品品質(zhì)（如豆腐、豆干等）、食品體系的結(jié)構(gòu)特性及調(diào)控意義重大[1-3]。大豆蛋白凝膠可以分為兩類：熱誘導(dǎo)凝膠和冷凝膠。前者是蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)（通?！?0%）加熱蛋白溶液至變性溫度以上并保持一段時(shí)間后冷卻至室溫或更低溫度，蛋白分子間通過疏水相互作用、二硫鍵等相互交聯(lián)，形成三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；后者則是在低于凝膠臨界蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（≤8%，通常為2%～6%）下加熱蛋白溶液至變性溫度以上，然后添加鹽類、酸或酶等誘導(dǎo)劑，促使蛋白交聯(lián)，形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[4-6]。Maltais 等[7]研究表明，與熱誘導(dǎo)凝膠不同，大豆蛋白冷凝膠的形成有以下兩個(gè)步驟：首先是在高于變性溫度的條件下加熱蛋白溶液，使蛋白的結(jié)構(gòu)伸展，活性基團(tuán)暴露；然后冷卻并添加Ca2+，誘導(dǎo)熱聚集體交聯(lián)、聚合，形成凝膠。Ca2+的作用是中和蛋白聚集體的靜電排斥力并在蛋白分子間形成鈣橋，進(jìn)而形成凝膠骨架，這種結(jié)構(gòu)主要由范德華力及疏水相互作用維持[7-8]。冷凝膠因其所需蛋白濃度較低、加熱時(shí)長(zhǎng)較短，在食品工業(yè)中的應(yīng)用較熱凝膠廣泛。在我國北方地區(qū)的鹵水豆腐就是含水量較高，由氯化鎂誘導(dǎo)的大豆蛋白冷凝膠。

溫度、pH 值、離子種類及強(qiáng)度等都會(huì)對(duì)大豆蛋白的凝膠特性造成影響[9-12]，其中離子的影響比較顯著。翁頔等[13]和楊芳等[14]發(fā)現(xiàn)，Na+、Ca2+、Mg2+對(duì)大豆蛋白凝膠的形成、質(zhì)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu)及水分狀態(tài)均有影響；Lakemond 等[3]指出，離子強(qiáng)度升高會(huì)顯著降低大豆球蛋白凝膠的持水性，凝膠的儲(chǔ)存模量隨著離子強(qiáng)度的上升呈現(xiàn)先上升后下降的變化，同時(shí)凝膠的粗糙程度與離子強(qiáng)度成正比；Lu等[1]研究表明，Ca2+濃度由0.02 mol/L 升至0.03 mol/L 時(shí)大豆蛋白凝膠的凝膠強(qiáng)度增加，而由0.03 mol/L 升至0.04 mol/L 時(shí)凝膠強(qiáng)度開始下降；Nagano 等[2]的試驗(yàn)表明，Na+有助于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，同時(shí)Mg2+對(duì)11S 凝膠的網(wǎng)絡(luò)平均密度影響很大，凝膠密度隨Mg2+濃度的升高而顯著增加，而大豆分離蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)平均密度對(duì)Mg2+濃度不敏感。

從前述研究可以看出，目前在金屬離子與大豆蛋白凝膠方面有較多的研究，研究方向多集中于Na+、Ca2+、Mg2+等常量元素，對(duì)諸如Zn2+、Cu2+等水中常見微量元素較少涉及。誘導(dǎo)劑也以氯化鈣、石膏等鈣鹽居多，鮮見采用氯化鎂。本研究以大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）為原料，通過流變學(xué)分析、質(zhì)構(gòu)分析等手段，探明鋅、銅等常見的微量元素對(duì)氯化鎂誘導(dǎo)的SPI 凝膠特性的影響，以期為傳統(tǒng)食品加工、食品體系的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，北京索萊寶科技有限公司；氯化鎂、氯化鋅、氯化銅，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氯化錳、氯化鐵，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；疊氮鈉，美國Sigma-Aldrich 試劑公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MCR-102 流變儀，奧地利安東帕公司；ZEN3700 納米粒度和Zeta 電位儀，英國馬爾文公司；TA.new plus 質(zhì)構(gòu)分析儀，美國ISENSO 公司；TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JC-2500 旋渦振蕩器，江蘇省金壇區(qū)白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州市亞榮儀器有限公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 分別配制不同濃度的含有Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+的溶液，將大豆蛋白粉溶解于含有不同濃度金屬離子的溶液中，使蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5%。大豆蛋白溶液在25 ℃條件下磁力攪拌2 h，使之充分水化并加入疊氮鈉（0.001%）以防止微生物污染。將大豆蛋白溶液在10 000 r/min 條件下離心10 min 以除去不溶物，取部分上清液進(jìn)行巰基及二硫鍵含量測(cè)定；將余下上清液轉(zhuǎn)移至水浴鍋內(nèi)，95 ℃加熱5 min 后迅速冷卻至25 ℃，制得大豆蛋白熱聚集體，用于測(cè)定聚集體粒徑；將充分水化后的大豆蛋白溶液轉(zhuǎn)移至水浴鍋內(nèi)，95 ℃加熱5 min，一部分迅速冷卻至25 ℃用于流變學(xué)測(cè)量，另一部分維持在85 ℃，以進(jìn)行凝膠質(zhì)構(gòu)特性、持水性測(cè)定。

1.3.2 流變學(xué)測(cè)量 采用改良的Liu 等[15]及Wang等[16]所述的方法測(cè)量大豆蛋白溶液的流變學(xué)行為。在大豆蛋白溶液中加入氯化鎂，使體系中Mg2+濃度達(dá)到0.01 mol/L，充分振搖后迅速吸取2.0～2.5 mL 滴加于MCR 102 流變儀的平板間。采用小振幅振蕩頻率掃描模式對(duì)大豆蛋白凝膠在不同離子種類及濃度下的動(dòng)態(tài)黏彈特性進(jìn)行表征。設(shè)定掃描頻率0.1～20 Hz，固定應(yīng)變0.1%，所有測(cè)量均在確定的線性黏彈性區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)溫度25 ℃，平板尺寸50 mm，板間距1 mm。在試驗(yàn)過程中，采集了具有頻率依賴性的儲(chǔ)能模量（G′）數(shù)據(jù)。每個(gè)試驗(yàn)至少做3 次平行。本試驗(yàn)中，將頻率掃描過程開始后得到第一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的G′值定義為起始G′值，將掃描過程結(jié)束后所得到的G′值定義為終止G′值。

1.3.3 粒徑測(cè)量 采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）法測(cè)定上清液中熱聚集體的粒徑。將處理后的上清液稀釋500 倍并過濾，取1.0～1.5 mL 濾液于塑料比色皿中進(jìn)行測(cè)定。測(cè)試溫度25 ℃，設(shè)定大豆蛋白的折射率為1.450，分散劑的折射率為1.000。

1.3.4 巰基及二硫鍵含量的測(cè)定 游離巰基含量測(cè)定采用Wang 等[16]的方法。取1 mL 上清液加入4 mL pH 值8.0 的Tris-Gly 緩沖溶液及50 μL DTNB 試劑，25 ℃保溫60 min 后在412 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ)412。

總巰基測(cè)定參考江連洲等[17]的方法。取1 mL上清液加入4 mL pH 值8.0 的Tris-Gly-尿素溶液、50 μL DTNB 試劑及50 μL 2-巰基乙醇，25℃反應(yīng)60 min；加入20 mL 12%三氯乙酸，25 ℃反應(yīng)60 min 后以5 000 r/min 離心10 min，取沉淀，用12%三氯乙酸洗滌2～3 次后加入10 mL pH 值8.0 的Tris-Gly 緩沖溶液搖勻，吸取4 mL 樣液并加入40 μL DTNB 試劑，25 ℃反應(yīng)60 min 后在412 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ)412。按如下公式計(jì)算游離巰基及總巰基的含量：

式中：A412——412 nm 波長(zhǎng)處的吸光值；D——稀釋倍數(shù)；C——樣品濃度，μmol/g。

按此公式計(jì)算二硫鍵的含量：

1.3.5 凝膠質(zhì)構(gòu)的測(cè)定 采用改良的Zhao 等[18]的方法對(duì)大豆蛋白凝膠進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測(cè)定。為方便測(cè)定，所有樣品在20 mL 塑料皿中制備。按照1.3.4節(jié)中的方法制備大豆蛋白凝膠，試驗(yàn)前需將凝膠在室溫下平衡至少30 min。質(zhì)構(gòu)儀使用TPA 模式，選擇P/36R 探頭，設(shè)定壓縮程度50%，測(cè)試前速度、測(cè)試中速度、測(cè)試后速度均為1 mm/s，停留時(shí)間5 s，觸發(fā)力5 g。采集了硬度與彈性的數(shù)據(jù)，并以硬度作為評(píng)價(jià)凝膠強(qiáng)度的指標(biāo)。每個(gè)試驗(yàn)至少做3 次平行。

1.3.6 凝膠持水性（WHC）的測(cè)定 采用改良的Wang 等[19]和Chen 等[20]所述的方法，對(duì)大豆蛋白凝膠的持水性進(jìn)行測(cè)定。本試驗(yàn)中，其被定義為離心后原凝膠質(zhì)量的損失率。在大豆蛋白溶液中加入氯化鎂，使體系中Mg2+濃度達(dá)到0.01 mol/L，充分振搖后在85 ℃條件下保溫10 min，然后在4 ℃冰箱內(nèi)靜置過夜，以使其充分形成凝膠。試驗(yàn)前需將凝膠在室溫下平衡至少30 min。稱取3 g 凝膠，于8 000 r/min 條件下離心20 min，棄去上清液，倒置離心管5 min 并用濾紙小心地吸干管壁內(nèi)殘留的水分后稱重。按如下公式計(jì)算凝膠的持水性：

式中：r——失水速率；m0——空離心管的質(zhì)量，g；m1——離心前凝膠與離心管的總質(zhì)量，g；m2——離心后凝膠與離心管的總質(zhì)量，g。每個(gè)試驗(yàn)至少做3 次平行。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0 和Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及數(shù)據(jù)處理，各組間均值比較采用S-N-K 分析法（P＜0.05），所有測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。圖像采用Origin 2018軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 金屬離子對(duì)大豆分離蛋白凝膠流變學(xué)特性的影響

儲(chǔ)能模量（G′）表示動(dòng)態(tài)振蕩各周期的能量?jī)?chǔ)備，代表著凝膠結(jié)構(gòu)的固體彈性和強(qiáng)度，兩者都對(duì)蛋白質(zhì)的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)有重要貢獻(xiàn)[18，21]。圖1顯示了各處理組的大豆蛋白凝膠在不同離子種類及濃度下G′的頻率依賴性?？梢杂^察到，所有樣品的G′值都隨著角頻率的增加而增加，顯示出良好的頻率依賴性。

如圖1a～1d 所示，添加金屬元素后各處理組的G′值顯著提升（P＜0.05），這表明凝膠的結(jié)構(gòu)與強(qiáng)度隨著金屬元素的加入而增強(qiáng)。其中鋅、銅、錳處理組的儲(chǔ)能模量變化趨勢(shì)較為相似，而鐵處理組的起始G′值明顯高于其它處理組，可能的原因是鐵離子所攜帶的正電荷數(shù)較高，相比于鋅、銅等二價(jià)離子其促進(jìn)蛋白分子間交聯(lián)的能力更強(qiáng)，從而使得凝膠的固體彈性增加。另外，各處理組G′值的變化與離子濃度呈正相關(guān)，這說明隨著離子濃度的升高，金屬元素與大豆蛋白的作用增強(qiáng)，促進(jìn)了蛋白間的相互作用，使得凝膠骨架的結(jié)構(gòu)得到加強(qiáng)，固體彈性明顯上升。這與Lu 等[1]以及Maltais 等[8]的部分研究結(jié)果相同，這是由于本試驗(yàn)采用的離子濃度較低，未能達(dá)到“轉(zhuǎn)折濃度”[13]，故未出現(xiàn)先上升后下降的變化。此外，當(dāng)鋅、銅、錳3種元素的質(zhì)量濃度均為0.05 mg/L 時(shí)，銅處理組的終止G′值最大（257.27 Pa），鋅處理組次之（250.03 Pa），錳處理組最小（249.68 Pa），此結(jié)果與3 種元素的電負(fù)性變化規(guī)律相吻合（Cu 1.9＞Zn 1.65＞Mn 1.55），元素的電負(fù)性越大，該元素中和蛋白表面電荷的作用越強(qiáng)，可以促使蛋白進(jìn)行更大程度的交聯(lián)，從而導(dǎo)致G′的增大。

圖1 微量金屬離子對(duì)大豆分離蛋白凝膠儲(chǔ)存模量的影響Fig.1 Effect of trace metal ions on storage modulus of soybean protein isolate gel

整體而言，金屬元素對(duì)大豆蛋白凝膠的固體彈性行為產(chǎn)生了顯著影響。隨著金屬元素的加入，大豆蛋白凝膠的G′值顯著提升，且G′值與離子濃度成正比，其中鐵離子的作用效果明顯強(qiáng)于鋅、銅、錳。

2.2 金屬離子對(duì)大豆蛋白聚集體粒徑的影響

通過粒度分析，可以評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的交聯(lián)和聚集的程度。添加不同金屬離子的大豆分離蛋白聚集體的平均粒徑如表1所示，可見金屬元素加入后聚集體的平均粒徑顯著增大（P＜0.05），且平均粒徑的變化與離子濃度呈正相關(guān)，其中鐵離子處理組尤為明顯。這種差異可能歸因于與聚集程度相關(guān)的正電荷數(shù)。三價(jià)離子和二價(jià)離子都能屏蔽蛋白質(zhì)分子間的靜電相互作用，但是三價(jià)離子所攜帶的正電荷比二價(jià)離子多，因此三價(jià)離子具有更強(qiáng)的屏蔽能力，可以交聯(lián)或橋接更多相鄰的帶電基團(tuán)，從而形成更大的聚集體，且濃度越高效果越明顯?？梢酝茰y(cè)，較高濃度的金屬離子可以更有效地促進(jìn)較大聚集體的交聯(lián)和聚集，且三價(jià)離子的效果強(qiáng)于二價(jià)離子。

表1 金屬元素對(duì)大豆分離蛋白粒徑的影響Table 1 Effects of metal elements on particle size of soybean protein isolate

2.3 金屬離子對(duì)大豆蛋白巰基和二硫鍵的影響

巰基對(duì)大豆蛋白的膠凝性能有重要的影響?？値€基基團(tuán)包含氧化態(tài)的巰基（-SH-）和還原態(tài)的二硫鍵（-S-S-），其中巰基組分既包括蛋白表面暴露的部分（即游離巰基），也包括在蛋白內(nèi)部埋藏的部分。金屬元素對(duì)大豆分離蛋白巰基和二硫鍵的影響見圖2。

如圖所示，隨著金屬離子的加入，各處理組的總巰基和游離巰基含量呈濃度依賴性下降，二硫鍵含量則隨著離子濃度的升高而上升。這可能是由于離子加入后引起蛋白分子聚集，蛋白分子間相互作用增強(qiáng)并形成鹽橋，進(jìn)而生成新的二硫鍵。另外，圖2d 中鐵離子加入后總巰基、游離巰基以及二硫鍵含量的變化幅度明顯高于其它處理組，一方面的原因是鐵離子攜帶的正電荷數(shù)較多，相比于二價(jià)離子其引起的聚集程度更大，另一方面可能歸因于鐵離子具有較高的氧化電勢(shì)，這有助于通過巰基的氧化形成新的二硫鍵。

圖2 微量金屬離子對(duì)大豆分離蛋白巰基和二硫鍵的影響Fig.2 Effects of trace metal ions on sulfydryl group and disulfide bond of soybean protein isolate

2.4 金屬離子對(duì)大豆蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

金屬離子對(duì)大豆分離蛋白凝膠強(qiáng)度的影響如表2所示。引入金屬離子后各處理組的凝膠強(qiáng)度均顯著上升（P＜0.05），且凝膠強(qiáng)度與離子濃度呈正相關(guān)，這說明金屬離子促進(jìn)了蛋白分子間的相互作用，它們的加入明顯增強(qiáng)了凝膠的結(jié)構(gòu)，且濃度越高作用越明顯；鐵離子加入后凝膠強(qiáng)度的上升幅度大于其它處理組，這可能與前述原因相同。此外，由表2及圖1可以看出凝膠強(qiáng)度的變化與G′呈正比，這與Donato 等[22]的結(jié)論相同，表明凝膠的固體彈性越高，凝膠強(qiáng)度越大。

表2 金屬元素對(duì)大豆分離蛋白凝膠強(qiáng)度的影響Table 2 Effects of trace metal elements on gel strength of soybean protein isolate

金屬離子對(duì)大豆分離蛋白凝膠彈性的影響如表3所示。鋅、銅、鐵處理組的彈性提升較為顯著，其中鋅、鐵處理組的彈性隨著離子濃度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)并分別在0.1，0.6 mg/L時(shí)達(dá)到彈性最大值，銅處理組的彈性則與離子濃度呈正相關(guān)；錳處理組的彈性隨著離子濃度的升高雖呈現(xiàn)出小幅上升的趨勢(shì)但是變化不顯著。這說明鋅、銅、鐵對(duì)凝膠彈性具有積極的影響，而錳對(duì)凝膠彈性幾乎沒有貢獻(xiàn)。另外，鋅、鐵處理組的彈性低于銅處理組，可能的原因是鋅離子和鐵離子可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，使分子鏈交聯(lián)和聚合，從而使部分分子鏈?zhǔn)椥?，?dǎo)致凝膠抵抗機(jī)械壓縮的能力較差[23-24]。

表3 金屬元素對(duì)大豆分離蛋白凝膠彈性的影響Table 3 Effects of trace metal elements on gel springiness of soybean protein isolate

2.5 金屬離子對(duì)大豆蛋白凝膠持水性的影響

凝膠的持水性是指通過凝膠基質(zhì)的毛細(xì)管作用來有效地固定水分的能力，是食品系統(tǒng)中最重要的特性之一[24]。如圖3a～3d 所示，所有處理組的失水速率均出現(xiàn)明顯升高，失水速率與離子濃度成正比并與粒徑的變化趨勢(shì)相同，表明持水性的變化與離子濃度和粒徑均呈負(fù)相關(guān)。其原因是較高的離子濃度會(huì)形成較大的聚集體，而由較大的聚集體構(gòu)成的凝膠孔隙較大，凝膠骨架與水的結(jié)合能力變?nèi)?，故較大粒徑聚集體形成的蛋白凝膠持水性較低，此結(jié)果與Wang 等[25]和Urbonaite等[26]的結(jié)論相同。結(jié)合圖1與圖2可以發(fā)現(xiàn)，凝膠的失水速率與G′成正比，表明凝膠的持水性與G′呈負(fù)相關(guān)，這與Urbonaite 等[27]的觀察結(jié)果相符，說明凝膠的固體彈性越大，蛋白之間的相互作用越強(qiáng)，蛋白與水的作用越弱，持水性越低。但該結(jié)論與Wang 等[21]及Yang 等[28]的研究相反，這可能是由于交聯(lián)劑不同導(dǎo)致的結(jié)果。此外，在圖3d 中，當(dāng)鐵離子加入后凝膠的失水速率顯著提高，這可能是由于鐵離子自身所帶電荷數(shù)較多，相比于二價(jià)離子，它的電荷屏蔽作用更強(qiáng)，降低了蛋白質(zhì)與水的相互作用，使得凝膠基質(zhì)中的水分更容易排出，進(jìn)而表現(xiàn)為較高的失水速率，這與已有的研究報(bào)道結(jié)果相同[25，29]。

圖3 微量金屬離子對(duì)凝膠持水性的影響Fig.3 Effects of trace metal ions on water holding capacity of gel

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過向大豆蛋白中添加ZnCl2、CuCl2、MnCl2和FeCl3，探究了金屬元素對(duì)氯化鎂誘導(dǎo)的大豆蛋白凝膠特性的影響?？梢园l(fā)現(xiàn)較之于對(duì)照組，添加金屬元素后凝膠的儲(chǔ)存模量、二硫鍵含量和凝膠強(qiáng)度顯著增加，熱聚集體尺寸明顯增大，凝膠的持水性和巰基含量則明顯下降，其中鐵離子的作用較為明顯；凝膠的儲(chǔ)存模量、二硫鍵含量、凝膠強(qiáng)度和熱聚集體尺寸與離子濃度成正比，持水性和巰基含量則與離子濃度成反比；鋅、銅、鐵對(duì)凝膠彈性具有積極影響，錳幾乎對(duì)凝膠彈性沒有貢獻(xiàn)。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)各處理組的凝膠強(qiáng)度與儲(chǔ)存模量呈正相關(guān)，凝膠的持水性與儲(chǔ)存模量及熱聚集體尺寸呈負(fù)相關(guān)。