let-7d-5p介導(dǎo)姜黃素的抗氧化作用

李媛媛，陳瑋鑫，曾 珺，劉靜雯，李 健，李桂玲*

（1集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建廈門361021 2福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心 福建廈門361021 3廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門361021）

姜黃素是從姜黃植物根莖中提取的一種植物多酚[1]，具有抗炎、抗腫瘤和抗氧化等多種功用[2]，常被用作食品添加劑或者膳食補(bǔ)充劑[3]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是含氧的高效氧化物，主要產(chǎn)生于線粒體內(nèi)膜的電子傳遞鏈中[4]。ROS 過度增加會(huì)破壞體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷[5-6]。研究表明姜黃素可以通過抑制活性氧產(chǎn)生來阻止細(xì)胞損傷及凋亡[7]?？寡趸到y(tǒng)的失衡也是導(dǎo)致心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等慢性疾病發(fā)生的重要原因之一[8]，同時(shí)ROS 的過量表達(dá)也會(huì)損傷肝臟功能，誘導(dǎo)多種肝臟疾病的發(fā)生[9]。姜黃素也可通過抑制慢性酒精引起的ROS 產(chǎn)生并增強(qiáng)肝臟的抗氧化能力[10]，對(duì)肝臟疾病起到一定的預(yù)防作用。然而，姜黃素的分子作用機(jī)制尚不明確。表觀遺傳調(diào)控包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和微小RNA（microRNA，miRNA）表達(dá)的調(diào)控[11]。有研究表明，姜黃素可能通過抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，調(diào)節(jié)miRNA 表達(dá)來發(fā)揮活性作用[12]。

miRNA 是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為20～25 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，通過種子序列 （5’ 端第2～8 位核苷酸） 識(shí)別靶信使RNA（mRNA）3’UTR 上的結(jié)合位點(diǎn)，攜帶RISC（RNAinduced silencing complex，RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合體）發(fā)揮作用[13]。miRNA 可以通過調(diào)節(jié)線粒體代謝來影響細(xì)胞活性氧水平[14]，也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化調(diào)控的相關(guān)因子。如miR-34a 及miR-93 是氧化防御過程中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄后抑制因子[15]。let-7 家族是表達(dá)豐度高的線粒體miRNA[16]，通過對(duì)相關(guān)基因的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗氧化活性。如let-7b、let-7c 可以間接調(diào)控細(xì)胞保護(hù)酶即血紅素加氧酶（HMOX1）來減輕人肝細(xì)胞的氧化損傷[17]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)miRNA 是姜黃素的新靶標(biāo)，姜黃素可以調(diào)節(jié)腦、腎及肝臟等相關(guān)疾病中幾種致病性miRNA 的表達(dá)，也可通過調(diào)節(jié)miR-181、miR-21和miR-19 等的表達(dá)在癌癥治療中發(fā)揮作用[18]。心血管和慢性腎臟等疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[19]，探究姜黃素是否通過對(duì)miRNA 的調(diào)節(jié)來發(fā)揮抗氧化作用，對(duì)闡述其活性作用的分子機(jī)制具有重要意義。

本研究通過尋找受姜黃素調(diào)節(jié)的miRNA，探究miRNA 對(duì)姜黃素抗氧化作用的影響，為姜黃素等功能食品的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝臟細(xì)胞系LO2 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

DMEM 高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合溶液，美國Hyclone 公司；胎牛血清，美國Gemini 公司；姜黃素，美國Sigma 公司；總抗氧化能力檢測試劑盒、ROS 檢測試劑盒、過氧化氫酶檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，美國Promega 公司；SYBR Premix Ex Taq II熒光定量試劑盒，大連寶生物工程有限公司；qPCR 引物、miRNA 陰性對(duì)照 （miR-NC）、let-7d-5p 類似物（let-7d-5p mimic），廣州銳博生物科技有限公司；TRIzol、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，美國Thermo Fisher 公司；其余有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VCX130PB 超聲波細(xì)胞破碎儀，美國Sonics公司；SYNERGY/H1 酶標(biāo)儀，美國Biotek 公司；ABI7300 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國Applied Biosystems 公司；Guava easyCyte 流式細(xì)胞儀，美國Millipore 公司；Forma 3111 細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司；5810R 高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及增殖率測定 LO2 細(xì)胞生長在添加1%雙抗溶液（青霉素-鏈霉素）和10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、充有5%CO2的恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞并制備成單細(xì)胞懸液，以1×104/孔的細(xì)胞密度接種于96 孔板中，貼壁后用姜黃素處理24 h，然后加入0.5 mg/mL 的四甲基噻唑藍(lán)（MTT）溶液孵育4 h，再加入DMSO 并振蕩10 min，在490 nm 下測定吸光度。以DMSO 為溶劑對(duì)照，計(jì)算公式如下：

式中：A0——空白對(duì)照上清液的吸光度；A1——溶劑對(duì)照上清液的吸光度；A2——姜黃素處理樣品上清液的吸光度。

1.3.2 ROS 水平檢測 利用熒光探針 （DCFHDA）檢測ROS 水平。DCFH-DA 本身無熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH 生成有綠色熒光的DCF。檢測DCF 的熒光強(qiáng)度即可知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。細(xì)胞收集后用10 μmol/L 的DCFH-DA 探針標(biāo)記30 min，然后用Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基清洗去除殘余染料并重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光強(qiáng)度（Ex/Em=488/525 nm）。

1.3.3 總抗氧化能力檢測 細(xì)胞收集后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗、超聲波破碎提取總蛋白，用BCA 法測定蛋白含量，并采用碧云天總抗氧化能力檢測試劑盒 （ABTS 法S0119、FRAP 法S0116）檢測細(xì)胞總抗氧化能力。

1.3.4 抗氧化酶活性檢測 樣品處理同1.3.3 節(jié)，采用南京建成生物工程研究所的總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（A001-3）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒（A005-1）和碧云天過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒（S0051）分別檢測細(xì)胞的抗氧化酶活性。

1.3.5 miRNA 的表達(dá)檢測 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測定miRNA 表達(dá)水平。即用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA 和用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后用SYBR Green 法進(jìn)行熒光定量PCR。以U6 為內(nèi)參，結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中：ΔΔCt=ΔCt（試驗(yàn)）-ΔCt（對(duì)照），ΔC=Ct（目的miRNA）-Ct（U6）。

1.3.6 miRNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 參照lipofectamine2000（Liopo2000）轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)轉(zhuǎn)染。即用Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基分別稀釋轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000 及miRNA 并靜置5 min，然后將其混合、靜置20 min 后再轉(zhuǎn)入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，6 h 后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 待用，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測miRNA 的轉(zhuǎn)染效率。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，數(shù)據(jù)以±s 表示。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

LO2 細(xì)胞用姜黃素處理24 h 后用MTT 法檢測其增殖率。不同濃度姜黃素對(duì)LO2 細(xì)胞增殖的影響如圖1所示。與對(duì)照相比，5 μmol/L 和10 μmol/L 姜黃素對(duì)細(xì)胞生長有一定促進(jìn)作用。隨著姜黃素濃度的繼續(xù)升高細(xì)胞增殖率開始下降，有細(xì)胞開始死亡，因此將20 μmol/L 設(shè)為姜黃素處理LO2 細(xì)胞的上限濃度。

圖1 姜黃素處理24 h 后LO2 細(xì)胞增殖率的變化Fig.1 Effect of 24 h curcumin treatment on the proliferation rate of LO2 cells

2.2 姜黃素降低ROS 水平

ROS 是細(xì)胞正常生理代謝下的產(chǎn)物，伴隨細(xì)胞的呼吸作用而產(chǎn)生。為了探究姜黃素對(duì)細(xì)胞抗氧化能力的影響，在確定姜黃素作用濃度后，采用DCFH-DA 探針法檢測姜黃素對(duì)ROS 水平的影響。細(xì)胞ROS 水平檢測結(jié)果如圖2所示，5～20 μmol/L 姜黃素處理細(xì)胞24 h 后，ROS 水平降低（P＜0.05）。提示姜黃素可能通過降低生產(chǎn)或提高清除能力減少ROS 的積聚。

圖2 姜黃素對(duì)LO2 細(xì)胞活性氧水平的影響Fig.2 Effect of curcumin on ROS level of LO2 cells

2.3 姜黃素提高總抗氧化能力

細(xì)胞內(nèi)存在多種有抗氧化能力的物質(zhì)，它們通過清除過量的ROS 來抵御ROS 所引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)?？偪寡趸芰醇?xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)的總水平，有不同的檢測模型及檢測手段，本研究采用ABTS 法及FRAP 法檢測。ABTS 法原理為ABTS 被氧化物氧化成綠色的ABTS 自由基（ABTS·+），而抗氧化物可以抑制綠色物質(zhì)的產(chǎn)生；FRAP 法原理為在酸性條件下抗氧化物可以還原鐵離子產(chǎn)生藍(lán)色的亞鐵離子。根據(jù)目標(biāo)待測物對(duì)ABTS 自由基清除和鐵離子（Fe3+）還原的能力可推測其抗氧化活性。姜黃素總抗氧化能力的檢測結(jié)果如圖3所示。姜黃素清除ABTS 自由基的能力顯著高于對(duì)照 （P＜0.05）（a），且能提高細(xì)胞內(nèi)的Fe3+還原能力（b）。這說明姜黃素處理可提高細(xì)胞抗氧化物質(zhì)的水平，即提高細(xì)胞的總抗氧化能力。

圖3 姜黃素對(duì)LO2 細(xì)胞總抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of curcumin on total antioxidant capacity of LO2 cells

2.4 姜黃素提高抗氧化酶活性

ROS 的消除包括內(nèi)源和外源系統(tǒng)?？寡趸赶凳羌?xì)胞內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的主要組成部分?？寡趸赴ǔ趸锲缁福⊿OD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等。SOD 通過歧化分解高氧化強(qiáng)度的超氧陰離子來抵御細(xì)胞的氧化損傷，CAT 通過催化過氧化氫產(chǎn)生水和氧氣降低過氧化氫含量，GSH-Px 可以催化過氧化氫和羥基自由基的分解來提高抗氧化能力。LO2 細(xì)胞抗氧化酶活性的檢測結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照相比，5 μmol/L 姜黃素可提高部分抗氧化酶的活性，而10 μmol/L 姜黃素處理后細(xì)胞的SOD、CAT 和GSH-Px 酶活性均顯著升高。但20 μmol/L 姜黃素處理導(dǎo)致CAT 酶活性有所下降，可能是因?yàn)樵摑舛认录?xì)胞死亡較多引起了復(fù)雜的反應(yīng)。這個(gè)結(jié)果提示抗氧化酶活性的升高可能是細(xì)胞總抗氧化能力提高的原因之一。

圖4 姜黃素對(duì)LO2 細(xì)胞抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of curcumin on antioxidant enzyme activities of LO2 cells

以上結(jié)果表明，姜黃素可能通過提高SOD、CAT 和GSH-Px 酶的活性降低LO2 細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平，提高細(xì)胞的總抗氧化能力。但具體的作用機(jī)制還有待研究。姜黃素對(duì)表觀遺傳具有調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，同時(shí)也可以通過調(diào)控miRNA 表達(dá)來發(fā)揮活性作用[20]。因此本文進(jìn)一步研究姜黃素對(duì)miRNA 表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

2.5 姜黃素上調(diào)let-7d-5p 的表達(dá)量

在前期研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素可調(diào)節(jié)不少miRNA 的表達(dá)水平，其中包含let-7 家族的多個(gè)miRNA（結(jié)果未顯示）。let-7d-5p 是let-7 家族的一員，姜黃素對(duì)其表達(dá)的影響如圖5所示。與對(duì)照相比，姜黃素處理后細(xì)胞內(nèi)let-7d-5p 表達(dá)量顯著增加，即姜黃素促進(jìn)let-7d-5p 表達(dá)。miRNA 參與調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)諸多過程，如細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝等。因此，本文進(jìn)一步研究了let-7d-5p 與姜黃素抗氧化活性的關(guān)系，即其是否可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的抗氧化能力。

圖5 姜黃素對(duì)LO2 細(xì)胞內(nèi)let-7d-5p 表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of curcumin on let-7d-5p expression level in LO2 cells

2.6 let-7d-5p 調(diào)節(jié)細(xì)胞的抗氧化能力

姜黃素上調(diào)let-7d-5p 的表達(dá)，因此本研究通過轉(zhuǎn)染let-7d-5p 類似物（let-7d-5p mimic）提高其在LO2 細(xì)胞內(nèi)的水平，并檢測細(xì)胞的抗氧化能力。如圖6a 所示，轉(zhuǎn)染類似物后，細(xì)胞內(nèi)let-7d-5p 的表達(dá)量顯著提高，說明轉(zhuǎn)染成功。對(duì)LO2 細(xì)胞ROS 水平檢測的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染let-7d-5p 類似物后，細(xì)胞ROS 水平顯著降低（P＜0.05）（圖6b、6c），提示let-7d-5p 提高細(xì)胞的抗氧化能力。對(duì)細(xì)胞抗氧化能力的其它測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染let-7d-5p 類似物后ABTS 自由基清除能力及鐵離子還原能力顯著提高（P＜0.05）（圖6d、6e）。let-7d-5p 還顯著提高SOD、CAT 和GSH-Px 的酶活力（圖6f）。這些數(shù)據(jù)表明，let-7d-5p 提高了細(xì)胞的抗氧化能力，提示miRNA 可參與細(xì)胞抗氧化能力的調(diào)控。

圖6 轉(zhuǎn)染let-7d-5p 類似物對(duì)LO2 細(xì)胞抗氧化能力的影響Fig.6 Effect of let-7d-5p upregulation on the antioxidant capacity of LO2 cells

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果顯示，姜黃素顯著下調(diào)ROS 水平，提高細(xì)胞總抗氧化能力；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，它也顯著提高SOD、CAT 和GSH-Px 的酶活力。但在20 μmol/L 姜黃素作用下CAT 酶活性有所回落，這可能是由于細(xì)胞死亡較多引起的復(fù)雜反應(yīng)[21]?？寡趸富钚缘奶岣咛崾窘S素可能通過激活內(nèi)源性細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)來降低ROS 水平，這與一些研究者的檢測結(jié)果相一致。Dai 等[22]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過增加SOD 活性，避免喹烯酮誘導(dǎo)LO2 細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激并阻止ROS 的形成。

越來越多的研究證據(jù)表明，miRNA 與細(xì)胞抗氧化關(guān)系密切。如miR-132 可以調(diào)節(jié)H9C2 細(xì)胞抗氧化及抗凋亡能力[23]。miR-1 可調(diào)節(jié)與氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，在心臟功能障礙相關(guān)疾病中發(fā)揮作用[24]。有證據(jù)表明姜黃素可調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)及功能。如通過調(diào)節(jié)PxBC-3 人胰腺癌細(xì)胞系中miR-22 和miR-199 的表達(dá)發(fā)揮治療作用[25]，或提高A549 細(xì)胞中miR-192-5p 和miR-215 的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[26]。但是對(duì)miRNA與姜黃素抗氧化關(guān)系的研究極少。

let-7 是與腫瘤發(fā)展相關(guān)的一個(gè)miRNA 家族。其中l(wèi)et-7g 被發(fā)現(xiàn)可減少ox-LDL 誘導(dǎo)的NADPH 氧化酶的增加和細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化能力[27]。let-7d-5p 是let-7 家族中的一員，主要調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)的基因表達(dá)[28]，對(duì)其與抗氧化能力調(diào)控的相關(guān)研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素顯著提高let-7d-5p 的表達(dá)量。為了闡明let-7d-5p 是否參與細(xì)胞的抗氧化能力調(diào)節(jié)，本研究通過轉(zhuǎn)染其類似物上調(diào)LO2 細(xì)胞中l(wèi)et-7d-5p 的水平，并檢測細(xì)胞的抗氧化能力。結(jié)果顯示，let-7d-5p 使LO2 細(xì)胞ROS 水平顯著下降，細(xì)胞總抗氧化能力及抗氧化酶活性顯著提高。這些結(jié)果表明，姜黃素通過上調(diào)let-7d-5p 的表達(dá)參與細(xì)胞抗氧化能力的調(diào)控。let-7d-5p 在細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)中可能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，但作用機(jī)理還有待研究。如let-7d-5p 通過什么方式提高細(xì)胞抗氧化能力，如何介導(dǎo)姜黃素的活性調(diào)控，姜黃素如何調(diào)節(jié)let-7d-5p 表達(dá)等。這些問題的答案將是姜黃素抗氧化作用機(jī)理的重要補(bǔ)充。姜黃素抗氧化活性的分子機(jī)制尚不明確，其作為抗氧化食品添加劑的理論依據(jù)還不夠充分。探究姜黃素抗氧化的分子機(jī)制對(duì)其功能活性及相關(guān)功能性食品的開發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。