桑枝多糖基于YAP/TAZ 信號(hào)通路調(diào)控db/db 小鼠腎纖維化作用的研究

余文勝 黃 飛 鄭 妮

糖尿病腎?。―N）是糖尿病常見(jiàn)的、嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，且超過(guò)三分之一的糖尿病患者伴發(fā)DN，并最終發(fā)展為終末期腎臟疾?。‥SRD），成為糖尿病致死、致殘的主要因素[1]。DN 臨床治療較為棘手，且尚缺乏特異性、針對(duì)性的治療藥物，目前主要以血糖控制為基礎(chǔ)，聯(lián)合抗氧化、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和鈣拮抗劑等藥物進(jìn)行綜合治療，但從臨床療效上看，目前的治療方案只是減緩腎功能減退及腎纖維化的發(fā)展，仍難以阻止其病程進(jìn)展[2-3]。

桑枝Mori Ramulus 是?？浦参锷orus alba L.的干燥樹(shù)枝，具有祛風(fēng)活絡(luò)、通利關(guān)節(jié)、燥濕利水、降血糖降血脂以及提高機(jī)體免疫功能等多種藥效[4-5]。桑枝多糖為桑枝的主要成分之一，課題組前期研究結(jié)果表明，桑枝多糖具有良好降血糖，增強(qiáng)糖尿病小鼠腎臟抗氧化能力，改善氧化應(yīng)激對(duì)腎組織損傷的作用[6]，但其對(duì)DN 的作用機(jī)制并未完全闡明。本研究以自發(fā)型2 型糖尿病db/db 小鼠為DN 模型，探究桑枝多糖對(duì)DN 的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 24 周齡db/db 小鼠40 只，db/m 小鼠10 只，SPF 級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量（47.27±1.62）g，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（蘇）2018-0027，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SYXK（蘇）2018-0008。小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的環(huán)境，室溫18～25℃，相對(duì)濕度40～70%，12h 光照晝夜循環(huán)。

1.2 藥 物 本研究應(yīng)用的桑枝經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究所鑒定。桑枝多糖制備[7]：干燥桑枝1kg，粉碎成粗粉，使用6000mL 80%的乙醇溶液，85℃下回流提取4次，每次2h，過(guò)濾，濾液減壓至無(wú)醇味，加2000mL 雙蒸水，煮3 次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液，10000pr/min離心10min，用微波真空干燥器濃縮，得濃縮液250mL，經(jīng)氯仿-正丁醇（5∶1）多次萃取后除去蛋白質(zhì)。提取液4℃過(guò)夜，10000pr/min 離心10min，過(guò)濾，加入5 倍量95%乙醇，使乙醇終濃度為70%，醇沉24h，抽濾，收集藥渣，濾渣依次用乙醚、無(wú)水乙醇、丙酮洗滌3 次，所得藥渣定性測(cè)定含粗多糖。將多糖粗品溶于水，加樣到經(jīng)PBS 緩沖液（pH=7.8）處理的樹(shù)脂層析柱中，靜止12h，用雙蒸水以2mL/min 流速進(jìn)行洗脫，合并洗脫液，真空干燥得桑枝多糖。經(jīng)紫外-可見(jiàn)分光計(jì)測(cè)定樣品中的桑枝多糖純度達(dá)85.6%；纈沙坦，海南皇隆制藥股份有限公司，批號(hào)191205。

1.3 試 劑 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、纖維連接蛋白（FN）、膠原Ⅰ型（CollagenⅠ）ELISA 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)200720、200811、200705、200716、200818；單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）ELISA 試劑盒，圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司，批號(hào)Sc-52734、Sc- 102086；兔抗人Yes 相關(guān)蛋白（YAP）、TEAD 多克隆抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，批號(hào)20271、20397。

1.4 主要儀器 9602A-酶標(biāo)儀（北京艾普生設(shè)備有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀（日立公司，7100）；Gel doc200 低溫高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；垂直電泳儀（BIO-RAD 公司）；轉(zhuǎn)膜及顯影設(shè)備（BIORAD 公司）；羅氏卓越型血糖儀（ACCU-CHEK Performa）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 自發(fā)型2 型糖尿病24 周齡db/db 小鼠40 只，24 周齡db/m 小鼠10 只，均雌雄各半。使用隨機(jī)數(shù)字表法將db/db 小鼠分為模型組、纈沙坦組（20mg/kg）、桑枝多糖低劑量組（600mg/kg）、桑枝多糖高劑量組（1200mg/kg），每組10 只，日常進(jìn)行高脂飲食喂養(yǎng)，連續(xù)灌胃相應(yīng)藥物60 天，每天1 次。db/m 小鼠為空白組，日常進(jìn)行普通飼料喂養(yǎng)，模型組與空白組小鼠灌胃等體積生理鹽水60 天。

2.2 HE 染色方法 將制作好的腎臟蠟塊切片，切片厚度4μm，切片用二甲苯脫蠟，置于二甲苯與純乙醇混合液中，乙醇逐級(jí)脫水，蘇木精染液染色，水洗及0.5%鹽酸乙醇分色，蒸餾流水沖洗，伊紅染液染色，乙醇逐級(jí)脫水后二甲苯透明，封片。觀察小鼠腎組織病理學(xué)變化。

2.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 于第60 天采集小鼠尿液，測(cè)量尿量，采用終點(diǎn)法測(cè)24h 尿白蛋白（UP）含量；末次給藥后，小鼠禁食不禁水12h，使用血糖儀檢測(cè)小鼠空腹血糖（FBG）；眼眶靜脈取血，高速冷凍離心分離血清，使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定小鼠血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）含量。

2.4 ELISA 法檢測(cè)小鼠腎組織纖維化指標(biāo) 剝離小鼠腎組織，低溫條件下將其制成約10%的勻漿液，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)小鼠腎組織TGFβ1、FN、CTGF、CollagenⅠ表達(dá)及炎癥因子TNF-α、IL-6、MCP-1 表達(dá)量。

2.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)小鼠腎組織YAP、TAZ 表達(dá)量 剝離小鼠腎組織，低溫條件下將其制成約10%的勻漿液，冰浴靜置30min，高速冷凍離心機(jī)中離心5min，分離上清液，提取腎組織總蛋白。在SDSPAGE 膠上加入Marker 及檢測(cè)蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后加5%脫脂奶粉，洗膜，加入一抗（1∶500），4℃低溫環(huán)境下孵育過(guò)夜，洗膜，加入稀釋的二抗（1∶2000），低溫靜置孵育60min，洗膜，暗室中曝光顯影。電泳成像分析系統(tǒng)掃描、分析蛋白條帶。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠FBG 的影響 與空白組比較，給藥前各組小鼠FBG 均明顯上升，給藥后，桑枝多糖低、高劑量組小鼠FBG 有所下降，但仍高于空白組（P<0.05）。與模型組給藥后比較，纈沙坦組小鼠FBG 無(wú)明顯改變（P>0.05），桑枝多糖低、高劑量組小鼠給FBG 均明顯降低（P 均<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠FBG 的影響（mmol/L，）

表1 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠FBG 的影響（mmol/L，）

注：空白組為db/m 小鼠，予生理鹽水；模型組為自發(fā)型2 型糖尿病db/db 小鼠，予生理鹽水；纈沙坦組為自發(fā)型2 型糖尿病db/db 小鼠予20mg/kg 纈沙坦混懸液；桑枝多糖低劑量組為自發(fā)型2 型糖尿病db/db 小鼠予600mg/kg 桑枝多糖混懸液；桑枝多糖高劑量組為自發(fā)型2型糖尿病db/db 小鼠予1200mg/kg 桑枝多糖混懸液；FBG 為空腹血糖；與空白組同期比較，aP<0.05；與本組給藥前比較，bP<0.05；與模型組給藥后比較，cP<0.05

3.2 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠24h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 的影響 與空白組比較，模型組小鼠24h尿量、UP 含量及血清Scr、BUN 含量明顯升高（P 均<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及桑枝多糖低、高劑量組小鼠24h 尿量、UP 含量及血清Scr、BUN 含量均明顯降低（P 均<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠24h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 的影響（）

表2 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠24h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 的影響（）

注：空白組為db/m 小鼠，予生理鹽水；模型組為自發(fā)型2 型糖尿病db/db 小鼠，予生理鹽水；纈沙坦組為自發(fā)型2 型糖尿病db/db 小鼠予20mg/kg纈沙坦混懸液；桑枝多糖低劑量組為自發(fā)型2 型糖尿病db/db 小鼠予600mg/kg 桑枝多糖混懸液；桑枝多糖高劑量組為自發(fā)型2 型糖尿病db/db 小鼠予1200mg/kg 桑枝多糖混懸液；UP 為尿白蛋白；Scr 為血清肌酐；BUN 為尿素氮；與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3.3 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織病理學(xué)變化 腎臟病理切片結(jié)果顯示，空白組小鼠腎小球數(shù)量多，分布廣泛，其結(jié)構(gòu)飽滿完整。模型組小鼠腎小球囊腔內(nèi)皺縮嚴(yán)重，腎小球基底膜均質(zhì)性增厚且出現(xiàn)大量空泡及細(xì)胞核固縮現(xiàn)象，數(shù)量較少。纈沙坦及桑枝多糖低、高劑量組小鼠腎小球囊腔皺縮程度減少，仍有空泡出現(xiàn)，腎小球數(shù)量較模型組多。見(jiàn)圖1。

圖1 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織病理學(xué)變化（HE 染色×400）

3.4 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織炎癥因子、趨化因子的影響 與空白組比較，模型組小鼠腎組織炎癥因子TNF-α、IL-6、MCP-1 含量顯著升高（P 均<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及桑枝多糖低、高劑量組小鼠腎臟TNF-α、IL-6、MCP-1 含量明顯降低（P 均<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織炎癥因子、趨化因子的影響（ng/L，）

表3 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織炎癥因子、趨化因子的影響（ng/L，）

注：空白組為db/m 小鼠，予生理鹽水；模型組為自發(fā)型2 型糖尿病db/db 小鼠，予生理鹽水；纈沙坦組為自發(fā)型2 型糖尿病db/db 小鼠予20mg/kg 纈沙坦混懸液；桑枝多糖低劑量組為自發(fā)型2 型糖尿病db/db 小鼠予600mg/kg 桑枝多糖混懸液；桑枝多糖高劑量組為自發(fā)型2型糖尿病db/db 小鼠予1200mg/kg 桑枝多糖混懸液；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；MCP-1 為單核細(xì)胞趨化蛋白-1；與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3.5 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織纖維指標(biāo)的影響與空白組比較，模型組小鼠腎組織TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ含量顯著升高（P 均<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及桑枝多糖低、高劑量小鼠腎臟TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ含量明顯降低（P 均<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織纖維指標(biāo)的影響（ng/mL，）

表4 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織纖維指標(biāo)的影響（ng/mL，）

3.6 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織YAP、TAZ 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠腎組織YAP、TAZ 蛋白表達(dá)顯著增加（P 均<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及桑枝多糖低、高劑量小鼠腎組織YAP、TAZ 蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。見(jiàn)表5、圖2。

圖2 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織YAP、TAZ 表達(dá)的影響

表5 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織YAP、TAZ 表達(dá)的影響（）

表5 桑枝多糖對(duì)db/db 小鼠腎組織YAP、TAZ 表達(dá)的影響（）

4 討論

DN 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要由于長(zhǎng)期的高血糖影響，造成腎小球血流動(dòng)力學(xué)的改變、引起腎小球高壓，腎臟系膜細(xì)胞受刺激后增殖、肥大，使基質(zhì)增生[8]。同時(shí)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的過(guò)度活躍和大量活性氧、炎癥因子的生成，導(dǎo)致腎小球足細(xì)胞損傷、提高腎臟細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的增殖水平，促使腎臟的炎癥及纖維化的發(fā)生[9]。腎臟纖維化是DN 進(jìn)入終末期的病理過(guò)程，其病程一般分為五期，主要以腎小球?yàn)V過(guò)率、腎小球毛細(xì)血管基底膜的厚度及寬度、蛋白尿、腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化等指標(biāo)判斷病程的發(fā)展。

腎小球和腎小管的巨噬細(xì)胞炎性浸潤(rùn)及其大量聚集，是糖尿病腎損傷的主要病理特征[10]。在高糖環(huán)境下，單核細(xì)胞在黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及趨化蛋白MCP-1 的作用下遷移到腎臟微環(huán)境，分化為巨噬細(xì)胞及進(jìn)一步活化，釋放炎癥因子TNF-α、IL-6及纖維化因子TGF-β1 等細(xì)胞因子，加重腎組織的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)腎臟局部慢性亞臨床腎炎，促使腎小球系膜細(xì)胞對(duì)ECM 的分泌增加，進(jìn)而引起成纖維細(xì)胞的增殖，系膜細(xì)胞外基質(zhì)沉淀腎小球硬化及間質(zhì)纖維化，促進(jìn)糖尿病腎纖維化的發(fā)展[11-12]。

YAP/TAZ 復(fù)合物是對(duì)進(jìn)化上有著高度保守的Hippo 信號(hào)通路的核心元件，其對(duì)器官大小的調(diào)控，腎臟成纖維細(xì)胞增生，肌成纖維細(xì)胞生成、分化、凋亡等重要的生物學(xué)過(guò)程均發(fā)揮著重要的作用。其中YAP 是調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子。腎臟正常狀態(tài)下，磷酸化的YAP 與14-3-3 調(diào)控蛋白結(jié)合，調(diào)控CTGF、FN、CollagenⅠ等下游靶因子的表達(dá)，維持細(xì)胞生存平衡[13]。腎臟高糖內(nèi)環(huán)境下，去磷酸化的YAP 會(huì)從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核遷移且活化，與組織TEAD 相互作用，激活重要的纖維因子CTGF，促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，以腎纖維化的方式修復(fù)慢性腎臟疾病的腎臟損傷[14]。TAZ 是YAP 的同源蛋白，在DN 的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。研究表明，TAZ 在腎臟足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞的高表達(dá)，可激活纖維蛋白CTGF 的表達(dá)，進(jìn)一步加重DN 的腎纖維化[15]。另外，由于YAP 誘導(dǎo)腎小管TGFβ1 表達(dá)，進(jìn)而刺激HK-2 細(xì)胞，導(dǎo)致TAZ 蛋白表達(dá)增加，引發(fā)HK-2 細(xì)胞的增殖缺陷，介導(dǎo)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成及腎纖維化的形成[16]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桑枝多糖能有效改善DN 小鼠腎功能及腎組織的病理變化，減低腎臟間質(zhì)纖維化指標(biāo)TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ、炎癥因子TNFα、IL-6 及趨化蛋白MCP-1 含量，以減緩腎臟間質(zhì)纖維的形成；同時(shí)降低腎組織YAP、TAZ 表達(dá)。提示，桑枝多糖可能通過(guò)調(diào)節(jié)腎組織YAP、TAZ 的蛋白表達(dá)，及抑制YAP/TAZ 信號(hào)通路下游的趨化蛋白MCP-1、纖維化指標(biāo)TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ及炎癥因子TNF-α、IL-6 生成，減緩腎臟間質(zhì)纖維的形成及炎癥因子對(duì)腎組織的攻擊損害，降低細(xì)胞外基質(zhì)合成，達(dá)到抗纖維化的作用。