不同鏈長直鏈糊精-維生素E復(fù)合物的制備及穩(wěn)定性研究

王馨甜,邱洪偉,盧浩,盧曉雪,田耀旗*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)2(諸城興貿(mào)玉米開發(fā)有限公司,山東 濰坊,262299)

直鏈糊精是一種由葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵連接而成的線性多糖[1],與直鏈淀粉具有相似的結(jié)構(gòu),其疏水性空腔由亞甲基和糖苷氧基團(tuán)構(gòu)成[2],當(dāng)溶液中存在合適尺寸的客體分子時(shí),不規(guī)則卷曲狀的直鏈糊精能夠與客體分子形成左手單螺旋結(jié)構(gòu)[3-4],因此可以用來包埋客體分子。目前通常使用環(huán)糊精作為包埋壁材,但環(huán)糊精空腔大小較為固定、成本較高,難以包埋大尺寸客體分子。而支鏈淀粉通過酶解脫支、醇沉分級(jí)得到一系列聚合度不同的直鏈糊精形成的螺旋空腔尺寸不固定,且不同鏈長直鏈糊精形成的螺旋空腔大小不盡相同[5-6]。近年來,以直鏈糊精為壁材包埋生物活性物質(zhì)逐漸受到關(guān)注[7-8],但對(duì)不同鏈長直鏈糊精對(duì)客體分子包埋特性的研究甚少。

維生素E是一種脂溶性維生素,作為最主要的抗氧化劑之一[9],具有延緩衰老和消除自由基[10]等功能。然而,維生素E對(duì)熱和光的不穩(wěn)定性嚴(yán)重限制了其在各領(lǐng)域的應(yīng)用[11]。本文選用維生素E為客體,以蠟質(zhì)玉米淀粉為原料,通過普魯蘭酶脫支,乙醇梯度溶解法分級(jí)得到幾種不同鏈長直鏈糊精,制備直鏈糊精-維生素E復(fù)合物,評(píng)價(jià)其耐熱、耐光穩(wěn)定性,以期為選擇合適鏈長直鏈糊精包埋生物活性分子提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠟質(zhì)玉米淀粉,杭州星普羅淀粉有限公司；普魯蘭酶(1 498 NPUN/g),美國Sigma試劑公司；無水乙醇、維生素E、無水磷酸氫二鈉、一水檸檬酸、己烷,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104E電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；ICS—5000+離子色譜儀,美國賽默飛世爾科技公司；Waters 1525EF高效液相色譜儀,美國沃特世公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；IS10傅里葉紅外光譜儀,美國Nicolet公司；D8-Advance型X-射線衍射儀,德國Bruker公司；TGA2熱分析系統(tǒng),瑞士梅特勒-托利公司；SCIENTZ-10 N冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司；ZF-1三用紫外分析儀,上海馳唐電子有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同鏈長直鏈糊精的制備

參考CHANG[12]和HU等[13]的方法并加以優(yōu)化。用pH 5.0～5.5的磷酸鹽緩沖溶液配制10%的蠟質(zhì)玉米淀粉乳,高壓滅菌鍋處理40 min,冷卻至55 ℃,加入體積為淀粉乳體積2%的普魯蘭酶,保溫24 h,沸水浴10 min滅酶,離心(4 500 r/min,8 min)后,將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇和大部分水,得到未分級(jí)的直鏈糊精(unfractionated linear dextrin,UNLD),真空冷凍干燥得到粉末；準(zhǔn)確稱取2 g UNLD,加入100 mL乙醇與水體積比為2∶1的乙醇溶液,60 ℃恒溫水浴攪拌4 h,離心(4 500 r/min,20 min)棄掉上清液,收集沉淀；向沉淀中加入乙醇與水體積比1∶1的乙醇溶液,60 ℃恒溫水浴攪拌4 h,離心(4 500 r/min,20 min)后將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇和大部分水,凍干得到的樣品命名為LD1∶1；繼續(xù)向沉淀中加入乙醇與水體積比1∶5的乙醇溶液,同樣的方法制備LD1∶5；沉淀用大量去離子水洗滌,干燥得到的樣品命名為LD>1∶5。

1.3.2 直鏈糊精鏈長及分子質(zhì)量測定

取25 mg樣品分散于5 mL超純水中,在恒定磁攪拌的油浴中加熱,使其完全糊化,過0.22 μm的濾膜備用。高效陰離子交換色譜系統(tǒng)裝備脈沖安培檢測器,色譜柱型號(hào)為戴安CarboPAC PA200。流動(dòng)相為150 mmol/L的NaOH溶液,流速為0.4 mL/min,進(jìn)樣量為25 μL。平均聚合度(degree of polymerization,DP)計(jì)算公式(1)為：

(1)

式中：n,峰序號(hào)；A,峰面積,nC·min。

分子質(zhì)量測定使用帶有保護(hù)柱的超水凝膠線性色譜柱(300 mm×7.8 mm,2 μm)。采用一系列不同分子質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(Mw2 700、9 750、135 030、300 600和2 000 000)作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 不同鏈長直鏈糊精-維生素E復(fù)合物的制備

取1 g直鏈糊精分散到100 mL去離子水中,加熱糊化后冷卻至70 ℃,取0.1 g 維生素E用少量無水乙醇溶解,待直鏈糊精溫度冷卻至70 ℃時(shí),逐滴加入維生素E-乙醇溶液,70 ℃下密封避光攪拌2 h以促進(jìn)兩者復(fù)合,待復(fù)合結(jié)束后緩慢冷卻至室溫,離心(10 000 r/min,10 min)后得到的沉淀用V(無水乙醇)∶V(蒸餾水)=50∶50的混合液洗滌2次后冷凍干燥,即為LD-維生素E復(fù)合物。采用同樣的方法作空白實(shí)驗(yàn),得對(duì)照品的直鏈糊精。質(zhì)量比為10∶1的直鏈糊精與維生素E物理混合即得物理混合物(LD+VE)。

1.3.4 直鏈糊精對(duì)維生素E負(fù)載量、包埋率的測定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取161.9 mg 維生素E樣品,用己烷溶解定容至100 mL,分別吸取維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4和5 mL置于25 mL容量瓶中,用己烷定容至刻度,搖勻。以己烷為空白對(duì)照,在200～400 nm全波長掃描,確定最大吸收波長。

在最大吸收波長處(285 nm)測量吸光值,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=0.004 6ρ-0.002 9(R2=0.999 9),A為吸光值,ρ為維生素E含量(μg/mL)。

1.3.4.2 負(fù)載量、包埋率的測定

取上述LD-VE分散于己烷中,超聲處理15 min,離心(10 000 r/min,10 min)后將沉淀重新分散到己烷中,重復(fù)3次,合并上清液,采用紫外分光光度法測定維生素E含量[14]。

負(fù)載量計(jì)算公式(2)為：

(2)

式中：ω,維生素E負(fù)載量,μg/mg；ρ,維生素E含量,μg/mL；V,樣品溶液總體積,mL；N,樣品稀釋倍數(shù)；m0,樣品質(zhì)量,mg。

包埋率按公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：Y,維生素E包埋率,%；m1,LD-VE復(fù)合物質(zhì)量,g；ω,維生素E負(fù)載量,μg/mg；m2,加入維生素E的質(zhì)量,g。

1.3.5 直鏈糊精-VE復(fù)合物結(jié)構(gòu)分析

1.3.5.1 傅里葉變換衰減全反射紅外光譜(attenuated total reflection flourier transformed infrared spectroscopy,ATR-FTIR)

取少量樣品平鋪于樣品臺(tái)上。實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：掃描波長為4 000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)為32次[15]。

1.3.5.2 X-射線衍射(X-ray diffraction,XRD)

掃描時(shí)采用NaI晶體閃爍計(jì)數(shù)器測量,掃描范圍3～40°,掃描速度4°/min[16]。采用Jade 5.0軟件進(jìn)行分析。

1.3.6 熱分析(thermogravimetric analysis,TGA)

稱取4 mg左右的樣品置于瓷坩堝中,從30 ℃升溫至500 ℃,升溫速率為10 ℃/min。測定過程中,樣品處于氮?dú)夥諊?氮?dú)饬魉贋?0 mL/min。通過對(duì)TGA曲線求導(dǎo)得到微商熱重分析(differentia thernmal gravity,DTG)曲線。

1.3.7 直鏈糊精-VE復(fù)合物的耐光穩(wěn)定性分析

將樣品置于紫外燈(254 nm)下照射,分別在照射的第0、1、3、5、10、24、36和48 h取樣,采用1.3.4的方法測定剩余維生素E的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Origin 2018軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和繪圖。使用SPSS 18.0進(jìn)行方差分析和Duncan顯著性分析以確定不同樣品之間的顯著差異,P<0.05表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異。所有實(shí)驗(yàn)平行測定3次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 直鏈糊精鏈長測定

普魯蘭酶是一類淀粉脫支酶,能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點(diǎn)中的α-1,6糖苷鍵,形成分子質(zhì)量分布廣的直鏈糊精UNLD。用乙醇梯度溶解法將UNLD分為3個(gè)組分：LD1∶1、LD1∶5和沉淀LD>1∶5。如圖1所示,分級(jí)后的直鏈糊精在DP 30～60部分呈現(xiàn)遞增趨勢。DP結(jié)果如表1所示,LD1∶1、LD1∶5和LD>1∶5的DP分別為14.53、16.20和25.25。當(dāng)加入較高含量的乙醇時(shí),短鏈溶解,長鏈沉淀[17]。因此,LD1∶1DP<6,DP 6～12和DP 13～24部分所占比例高于LD1∶5和LD>1∶5。隨著乙醇含量的降低,直鏈糊精長鏈部分在溶液中的溶解量增加,因此,LD1∶5長鏈部分(DP 25～36和DP ≥ 37)所占比例高于LD1∶1。沉淀LD>1∶5長鏈部分比例分別達(dá)到21.91%和21.68%,顯著高于LD1∶5。

圖1 分級(jí)前后直鏈糊精鏈長分布

表1 分級(jí)前后直鏈糊精鏈長分布

LD1∶1、LD1∶5和LD>1∶5的重均分子質(zhì)量(Mw)分別為1 450、1 971和2 436 Da。不同分子質(zhì)量的直鏈糊精在同一乙醇溶液中溶解度不同,即分子質(zhì)量與溶解度呈負(fù)相關(guān)。乙醇含量降低導(dǎo)致各組分分子質(zhì)量增加,其順序?yàn)長D1∶11∶5,與鏈長分布結(jié)果呈現(xiàn)相同趨勢。結(jié)果表明,乙醇梯度溶解法可以有效地將直鏈糊精分離成平均鏈長和分子質(zhì)量不同的組分。

2.2 直鏈糊精對(duì)維生素E的負(fù)載量和包埋率

不同鏈長直鏈糊精對(duì)VE負(fù)載量和包埋率如圖2所示。隨著直鏈糊精鏈長增加,包合物中維生素含量以及直鏈糊精對(duì)維生素包埋率都呈現(xiàn)遞增趨勢。當(dāng)直鏈糊精的DP由14.53增加至25.25時(shí),直鏈糊精對(duì)維生素E負(fù)載量從45.97 μg/mg提高至62.71 μg/mg,維生素E包埋率從39.07%增加至59.57%。因此,可以說明直鏈糊精的鏈長對(duì)維生素E負(fù)載量、包埋率有影響,且鏈長長的直鏈糊精對(duì)維生素E負(fù)載量和包埋率高。

圖2 不同鏈長直鏈糊精對(duì)維生素E的負(fù)載量和包埋率

2.3 直鏈糊精-VE復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 FTIR分析

如圖3所示,LD1∶1、LD1∶5和LD>1∶5在3 600～2 990 cm-1的寬吸收峰是由于-OH的伸縮振動(dòng)引起的,而2 925 cm-1的峰與-CH2的碳?xì)洳粚?duì)稱伸縮振動(dòng)有關(guān)[18]。1 016、1 076和1 147 cm-1處的3個(gè)強(qiáng)吸收峰分別對(duì)應(yīng)C—C與C—O伸縮振動(dòng)和C—H彎曲振動(dòng)。

LD-VE-直鏈糊精與維生素E復(fù)合物；LD+VE-直鏈糊精與維生素E的物理混合物；圖中a,b和c分別為A,B和C細(xì)節(jié)放大圖

2.3.2 XRD分析

圖4為LD和LD-VE的XRD譜圖。LD1∶1、LD1∶5和LD>1∶5在5.6、14、17和22.3°附近出現(xiàn)衍射峰,表明直鏈糊精為較弱的B-型結(jié)構(gòu)。維生素E的X-射線衍射圖譜呈現(xiàn)一個(gè)大而寬的晶胞,表明其具有非結(jié)晶性、無定形的特性。復(fù)合物在5.7、17、19.5和22°等處出現(xiàn)衍射峰,呈現(xiàn)較弱的B-+V-型結(jié)構(gòu)。LD1∶1-VE、LD1∶5-VE和LD>1∶5-VE的相對(duì)結(jié)晶度分別為26.5%、33.7%和41.9%,說明鏈長較長的直鏈糊精與維生素E形成的結(jié)晶結(jié)構(gòu)更緊密,與負(fù)載量結(jié)果一致。

圖4 不同鏈長直鏈糊精及其與維生素E復(fù)合物的XRD圖譜

2.4 直鏈糊精-VE復(fù)合物耐熱穩(wěn)定性分析

采用TGA分析LD-VE耐熱穩(wěn)定性,如圖5所示。LD1∶1呈現(xiàn)雙裂解峰,峰值溫度分別是233和298 ℃,LD1∶1-VE峰值溫度分別為249和305 ℃。LD1∶5和LD>1∶5的失重表現(xiàn)為2個(gè)階段,第1階段是結(jié)合水減少造成的失重,第2階段是直鏈糊精熱降解造成的失重。LD1∶5和LD>1∶5的裂解峰值溫度分別為312和318 ℃,復(fù)合物在熱降解階段后移形成更高的裂解溫度,分別為318和321 ℃。結(jié)果表明LD與維生素E復(fù)合提高了維生素E耐熱穩(wěn)定性。

圖5 直鏈糊精與直鏈糊精-VE復(fù)合物的TGA分析

2.5 直鏈糊精-維生素E復(fù)合物耐光穩(wěn)定性分析

維生素E中存在酚羥基和β-二酮基團(tuán),使其對(duì)光較敏感[14]。如圖6所示,隨著照射紫外線的時(shí)間的增加,所有樣品的維生素E保留率都有所下降,經(jīng)過48 h的紫外光照射后,游離維生素E的保留率僅為59.52%,而復(fù)合后的維生素E保留率分別為78.73%(LD1∶1)、82.01%(LD1∶5)和89.19%(LD>1∶5),說明直鏈糊精對(duì)維生素E起到了保護(hù)作用,顯著提高了其耐光穩(wěn)定性。鏈長長的直鏈糊精與維生素E之間的相互作用更強(qiáng),復(fù)合物的結(jié)構(gòu)更加緊密,從而具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。

圖6 游離VE和不同鏈長直鏈糊精-維生素E復(fù)合物的光降解曲線

3 結(jié)果與討論

制備了不同鏈長直鏈糊精與維生素E復(fù)合物,發(fā)現(xiàn)直鏈糊精對(duì)維生素E的負(fù)載量和包埋率受直鏈糊精鏈長的影響,長鏈直鏈糊精對(duì)維生素E負(fù)載量和包埋率高于短鏈的直鏈糊精。直鏈糊精與維生素E通過氫鍵作用形成復(fù)合物,且鏈長長的直鏈糊精與維生素E形成的復(fù)合物更穩(wěn)定。復(fù)合物的形成提高了維生素E的耐熱、耐光穩(wěn)定性,長鏈直鏈糊精(LD>1∶5)對(duì)維生素E的保護(hù)效果優(yōu)于短鏈(LD1∶1和LD1∶5),為不同鏈長直鏈糊精包埋疏水性客體分子提供了指導(dǎo),有望擴(kuò)大不同鏈長直鏈糊精在包埋領(lǐng)域的應(yīng)用。