胃幽門螺桿菌感染后semaphorin 5A和TGF-β1的表達及其相關(guān)性研究

李 庚 何 穎 潘國慶

幽門螺旋桿菌(helicobacter pylori，Hp)感染是我國人群最常見的細菌病原體之一，最新報告顯示國人感染率高達55%左右[1]。Hp作為啟動子通過胃粘膜定植并形成胃粘膜相關(guān)病變，根據(jù)Correa級聯(lián)反應(yīng)[2]，病變逐漸發(fā)展為胃癌，這一過程伴隨著基因失活與激活機制的改變[3]。近年來，人類對胃癌精準(zhǔn)性與靶向治療的需求與日俱增，而其理論及構(gòu)想必然基于胃癌相關(guān)的基因的研究?；蛐盘査?A(semaphorin 5A)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)在胃癌及癌前病變中已有多次報道[4-6]，然而Hp對semaphorin 5A、TGF-β1的影響尚未完全明確，因此本文就Hp感染狀態(tài)下的實驗動物及人胃腺癌組織中semaphorin 5A和TGF-β1表達情況做一初步研究，為Hp介導(dǎo)胃癌發(fā)生、發(fā)展機制研究提供一定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

小蘇打，Giemsa及W-S銀染液購于Solarbio公司；一抗semaphorin 5A、TGF-β1及β-actin抗體分別購于美國RD，Abcam，Sigma公司；ABI-7500實時熒光定量PCR儀購于美國ABI公司；試劑盒活性檢測購于上海Beyotime生物工程有限公司，Real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；轉(zhuǎn)膜儀及SDS-PAGE電泳設(shè)備購于美國Bio-rad公司；PVDF膜、ECL超敏發(fā)光液購自德國Merck公司等。

1.2 幽門螺桿菌的培養(yǎng)

于-80 ℃冰箱取出ATCC26695菌株，水浴復(fù)蘇，種植于含5%無菌脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，放入微需氧培養(yǎng)罐中置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后自然冷卻至50 ℃時添加脫纖維羊血及多粘菌素B，萬古霉素，兩性霉素，TMP混勻后澆板。將菌落形態(tài)的Hp懸浮于PBS中，測定OD660，1OD660=1×108菌落形成單位(CFU)。

1.3 模型鼠制備及分組

30只SPF級SD大鼠，6～ 8周齡，雌雄各半體質(zhì)量180～ 200 g，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(合格證：NO.201917016)。大鼠隨機分為對照組、感染組，每組各15只。均在SPF級動物實驗室干濕適宜條件下，雌雄分開，分籠飼養(yǎng)。循環(huán)晝夜光照間隔12 h切換，室內(nèi)溫度為20 ℃ ～ 24 ℃。感染組大鼠每只用胃管喂以5%NaHCO32ml灌胃，半小時后用Hp培養(yǎng)細菌懸液4 ml進行灌胃(5×108CFU/ml)，對照組灌胃等劑量PBS。每周感染大鼠2次，共8次，Hp末次灌胃結(jié)束后，分別繼續(xù)常規(guī)飼料飼養(yǎng)3個月。

1.4 標(biāo)本處理及Hp檢測

大鼠麻醉固定后，快速取出全胃,沿胃大彎剪開,用冷生理鹽水沖洗后，一分為二，分別于多聚甲醛固定和-80 ℃保存?zhèn)溆么郎y。分別于最后一次灌胃3月后取材，進行造模成功指標(biāo)檢測。胃黏膜石蠟Giemsa及W-S染色檢查檢測出Hp，均陽性說明造模成功。

1.5 RT-qPCR法檢測組織中semaphorin 5A，TGF-β1的mRNA表達情況

胃組織中總RNA提取及cDNA合成:參照Trizol提取胃組織的總RNA,在nanodrop-2000上測260 nm/280 nm比值達到1.8至2.0后,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法得到cDNA。引物設(shè)計結(jié)果見表1。實時熒光定量RT-qPCR擴增程序用熒光定量檢測試劑盒，在Bio-Rad熒光定量PCR儀上擴增。擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸60 s，40個循環(huán)。分析結(jié)果，得出各組內(nèi)參基因和目的基因Ct值，運用2-△△Ct公式計算。

表1 引物序列

1.6 免疫印跡檢測組織中semaphorin 5A和TGF-β1的蛋白表達情況

選取Hp感染組及對照組大鼠胃組織加RIPA裂解液冰上裂解，提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。加入樣品緩沖液后沸水浴變性，離心后上樣，電泳分離，轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉，加入抗semaphorin 5A、TGF-β1及β-actin抗體后4 ℃過夜。一抗孵育結(jié)束后，洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜后入ECL發(fā)光，凝膠成像分析曝光數(shù)據(jù)，上Image-J圖像，計算灰度值。

1.7 胃癌標(biāo)本收集及免疫組織化學(xué)檢測組織中semaphorin 5A和TGF-β1的蛋白表達情況

收集本院2018至2019年胃癌切除術(shù)后診斷為胃腺癌石蠟組織100例，所有患者手術(shù)前未經(jīng)過放化療并有幽門螺桿菌感染病史。收集的蠟塊切片脫蠟至水，EDTA抗原修復(fù)，過氧化氫消除內(nèi)源性酶，分別加入同WB的一抗和二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。免疫組化結(jié)果判定：通過評分SEMA5A和TGF-β1染色陽性百分率和染色強度來確定表達水平。隨機選取組織中3個區(qū)域，共300個細胞，計數(shù)免疫陽性細胞數(shù)，得分為0.1(陽性細胞的 1%～10%)，0.2(陽性細胞的 11%～20%)，和 0.3(20%～30%的細胞呈陽性)，依此類推。此外，強度被指定為弱(1分)，中(2 分)，強(3 分)或非常強(4分)。通過將陽性細胞的范圍乘以強度來計算 IHC 綜合評分。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠 Hp定值及組織HE炎癥結(jié)果

首先收集感染大鼠胃組織樣本，再通過Giemsa染色及W-S銀染顯示胃粘膜可見Hp定植。鏡下Giemsa染色背景為藍色，Hp為深藍色桿狀。W-S銀染背景為棕黃色，Hp呈黑色桿狀。隨著灌胃時間的延長，胃粘膜表面Hp也逐漸增多。

HE染色顯示：感染組大鼠多量胃粘膜上皮脫落及壞死樣物，隨之感染時間延長，胃黏膜炎癥細胞也隨之出現(xiàn)，主要為淋巴細胞，部分可達粘膜下層。而對照組鏡下未見明顯炎癥改變。

2.2 Hp感染對大鼠胃黏膜semaphorin 5A，TGF-β1mRNA表達的影響

如圖1所示，隨著Hp感染3個月后，semaphorin 5A及TGF-β1的mRNA表達水平較對照組表達均有上升(P<0.01)，見表2。

圖1 各組胃粘膜中semaphorin 5A，TGF-β1 mRNA表達情況

表2 各組胃組織中semaphorin 5A和TGF-β1 mRNA表達水平比較

2.3 Hp感染對大鼠胃黏膜semaphorin 5A，TGF-β1蛋白表達的影響

WB結(jié)果顯示和PCR結(jié)果一致，即Hp感染后能夠明顯上調(diào)semaphorin 5A、TGF-β1在胃粘膜內(nèi)的表達。圖2的B-C為semaphorin 5A和TGF-β1與β-actin的相對灰度值。

圖2 各組胃組織中semaphorin 5A，TGF-β1蛋白表達情況

2.4 Hp感染對人胃腺癌semaphorin 5A，TGF-β1表達的影響

選取100例胃腺癌組織經(jīng)Giemsa染色結(jié)果顯示，100例胃癌中有54例為Hp+，46例為Hp-。 Hp陽性的胃腺癌組織，其中放大的癌旁腺體內(nèi)見Hp；semaphorin 5A和 TGF-β1在Hp陽性胃癌腺體的細胞膜或質(zhì)中呈強陽性反應(yīng)；而在Hp陰性胃癌腺體的細胞質(zhì)中呈中度陽性反應(yīng)。二種蛋白免疫組化評分在Hp+組均高于Hp-組，P分別為0.002，0.007，均小于0.01。在Hp+后胃腺癌中semaphorin 5A表達與TGF-β1表達呈正相關(guān)(γ=0.762，P=0.001)，見表3。

表3 Hp+組和Hp-組semaphorin 5A、TGF-β1表達的差異

3 討論

胃癌的發(fā)生是1種多過程、多階段疾病，幽門螺桿菌作為胃癌I類致癌原,約90%非賁門部胃癌的發(fā)生與Hp感染相關(guān)。Hp作為誘發(fā)胃癌的始動因素，利用毒力因子，通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)使其在胃粘膜上皮內(nèi)粘附引起宿主免疫應(yīng)答，細胞增殖凋亡失衡，癌基因和抑癌基因的表達改變，最終導(dǎo)致胃癌[7-8]。然而，Hp感染具體調(diào)控細胞增殖凋亡失衡的分子機制有待進一步明確。有研究顯示，semaphorin 5A與細胞增殖、凋亡過程有關(guān)[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染后的GES-1細胞中，semaphorin 5A表達上調(diào)。有趣的是，該研究同時發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞中，semaphorin 5A亦呈高表達。

Semaphorin 5A，是semaphorins家族5類中的成員。Semaphorins又稱為軸突導(dǎo)向分子，即在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中引導(dǎo)軸突到達靶位點。后來發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)節(jié)多種生理過程，包括胚胎心血管發(fā)育和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，更為重要的是發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中有異常表達，并且與癌癥相關(guān)的腫瘤脈管形成和癌細胞轉(zhuǎn)移有很大的關(guān)聯(lián)性[10]?，F(xiàn)階段多項研究表明，semaphorin 5A作為1種胃癌相關(guān)基因，能夠在胃癌中高表達并且可以調(diào)控癌細胞的生物學(xué)活性[11-12]。有報道指出semaphorin 5A和TGF-β1在結(jié)構(gòu)上存在相同的結(jié)構(gòu)域TSP-1(血小板反應(yīng)素)[13]，而TSP-1恰恰是活化TGF-β1的關(guān)鍵。在此理論基礎(chǔ)上潘[14]利用RNAi技術(shù)在胃癌細胞實驗上顯示semaphorin 5A可以激活TGF-β1，證實TGF-β1為其下游信號分子。

現(xiàn)階段研究表明TGF-β1在胃癌晚期起促進作用，包括腫瘤新生脈管形成、細胞黏附性降低、免疫抑制等效應(yīng)[15]。該效應(yīng)與semaphorin 5A在腫瘤中的生物學(xué)功能具有高度一致性。在本次實驗中，我們也發(fā)現(xiàn)Hp感染后TGF-β1的表達量明顯上升，具有統(tǒng)計學(xué)意義，與其他同類型的Hp相關(guān)性實驗相一致。如馬等[16]通過觀察臨床患者外周血清顯示慢性活動性胃炎伴Hp陽性患者、TGF-β1水平高于陰性對照組，胃粘膜嚴(yán)重程度同樣升高。柳等[17]研究也顯示TGF-β1蛋白在Hp+胃癌石蠟標(biāo)本中表達量更高。據(jù)此，我們推測，Hp感染后TGF-β1作為semaphorin 5A下游信號分子影響胃癌發(fā)病過程。

基于以上假設(shè)，我們參照史等[18]的方法構(gòu)建體內(nèi)動物模型，經(jīng)檢測，模型符合洛桑會議幽門螺桿菌感染標(biāo)準(zhǔn)[19]。進一步結(jié)果顯示，隨著Hp感染時間的延長，semaphorin 5A表達量要顯著高于對照組(P<0.01)，胃癌石蠟樣本中同樣Hp+組要顯著高于對照組(P<0.01)，提示Hp能夠引起上調(diào)胃粘膜semaphorin 5A表達。這與先前我們在胃癌前病變，包括人GES-1細胞與Hp共培養(yǎng)的體外實驗均證明Hp感染能夠上調(diào)semaphorin 5A表達量相一致[5，20]。通過觀察動物實驗時間節(jié)點發(fā)現(xiàn)semaphorin 5A與TGF-β1表達量與Hp感染呈正相關(guān)，隨著時間延長炎癥嚴(yán)重程度也在加重，也符合Hp感染相關(guān)性胃炎的病理生理學(xué)改變。同時，本實驗分析胃癌組織在蛋白水平的semaphorin 5A與TGF-β1表達的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，semaphorin 5A與TGF-β1呈正相關(guān)，提示Hp可能協(xié)同semaphorin 5A與TGF-β1在胃癌中進程發(fā)展，進一步證實了我們假設(shè)。

當(dāng)然，本研究中仍然存在諸多不足。首先，由于時間限制，我們的動物模型尚未出現(xiàn)癌前病變的特征性表現(xiàn)；其次TGF-β1表達的上調(diào)是由于Hp感染直接引起，還是由于semaphorin 5A的表達升高，進而激活相關(guān)信號通路間接引起，還有待進一步探討；最后，Hp感染后引起semaphorin 5A/TGF-β1信號軸的下游分子通路有待進一步明確。

綜上所述，我們使用在時間點(3月)獲得Hp感染大鼠模型，并分析得出semaphorin 5A和TGF-β1在大鼠及人Hp相關(guān)性胃粘膜病變中的表達上調(diào)，且在胃癌組織兩者表達具有正相關(guān)性。可進一步證實Hp誘導(dǎo)胃粘膜相關(guān)病變的發(fā)生，其機制可能與Hp激活semaphorin 5A/ TGF-β1信號通路有關(guān)。據(jù)此，我們可以初步認(rèn)為，Hp感染可能通過semaphorin 5A/TGF-β1信號軸介導(dǎo)胃癌發(fā)生。