水燭香蒲不同部位黃酮類化合物的動態(tài)分析

巢蕾 高明亮 曹雨誕 陳佩東 嚴輝

摘 要： ?為了分析水燭香蒲花粉和莖葉中黃酮類成分，以及不同生長期、不同部位中香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷和異鼠李素含量。該文采用UPLC-Q-TOF-MS進行定性分析，結(jié)合HPLC法對水燭香蒲不同部位中黃酮類化合物含量進行分析評價，色譜條件為PRAZIS C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.05%磷酸為流動相，梯度洗脫，體積流量1.0 mL·min-1，檢測波長254 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果表明：（1）花粉及莖葉中共解析出42個化合物，其中8個化合物在不同部位中有差異。（2）同一生長環(huán)境的水燭香蒲不同生長時期、不同部位中3種黃酮類化合物的含量差異較大。（3）異鼠李素-3-O-新橙皮苷及異鼠李素在香蒲的發(fā)育生長過程中含量呈先增加后下降的趨勢，莖葉內(nèi)的這兩種成分含量下降明顯;在花粉中，香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量急劇上升，一周內(nèi)達到峰值;莖葉中香蒲新苷含量較低，在大多數(shù)樣品中未檢出。該研究所建立的測定方法簡便、重現(xiàn)性好，并對水燭香蒲中黃酮類成分的含量變化規(guī)律進行了研究，對花粉及莖葉中化合物差異進行了分析，為蒲黃的合理采收及香蒲植物的資源化利用提供了科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 水燭香蒲， 香蒲新苷， 異鼠李素-3-O-新橙皮苷， 異鼠李素， 動態(tài)分析

中圖分類號： ?Q946

文獻標識碼： ?A

文章編號： ?1000-3142（2021）05-0831-12

Abstract： ?Inorder to analyze flavonoids in pollen， stem and leaf of Typha angustifolia and the contents of typhaneoside， isorhamnetin-3-O-neohesperidoside and isorhamnetin in different parts of growth periods. UPLC-Q-TOF-MS was used for qualitative analysis， combined with HPLC to analyze and evaluate the contents of flavonoids in different parts of T. angustifolia. A RPAZIS C18 column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） was adopted. The mobile phase was composed of acetonitrile-0.05% phosphoric acid with a gradient elution. The flow rate was 1.0 mL·min-1， the detection wavelength was 254 nm， and the column temperature was 30 ℃. The results were as follows： （1） A total of 42 compounds were identified in pollen， stem and leaf， and eight compounds with great differences in different parts. （2） The contents of three flavonoids in different parts of T. angustifolia during different growth periods in the same growth environment were significantly different. （3） The contents of isorhamnetin-3-O-neohesperidoside and isorhamnetin in the plant were increased first and then decreased， while decreased significantly in the stem and leaf; In pollen， the contents of typhaneoside and isorhamnetin-3-O-neohesperidoside increased quickly and reached a peak within a week; The contents of isorhamnetin in stem and leaf were low and were not detected in most samples. This established method in this study was simple and reproducible. The changes regularity of the flavonoids content in T. angustifolia had been studied and the differences of compounds in pollen， stem and leaf were also analyzed. This research provides a scientific basis for reasonable resource utilization of T. angustifolia.

Key words： ?Typha angustifolia， typhaneoside， isorhamnetin-3-O-neohesperidoside， isorhamnetin， dynamic analysis

香蒲屬（Typha）植物為香蒲科（Typhaceae）多年生水生或沼生植物，廣泛分布于熱帶至溫帶地區(qū)（王茹等，2013），全世界有24種，其中我國分布有12種?！吨袊幍洹?015版規(guī)定，蒲黃藥材為水燭香蒲（Typha angustifolia）、東方香蒲（T. orientalis）或同屬植物的干燥花粉（國家藥典委員會，2015），具有止血、化瘀、通淋之功效（代玄燁，2017）。蒲黃中含有黃酮類、酚酸類、腦苷、腺苷、甾體類及多糖類等多種成分（陳毓等，2015;白雪薇等，2018;Zeng et al.， 2018），其中黃酮類成分為其主要有效成分，具有改善胰島素抵抗、抑制炎癥、改善血液流變學狀態(tài)以及止血及抗氧化等作用（Chen et al.， 2017;Lei et al.， 2018）。

香蒲屬植物的莖葉與花粉的化學成分組成類似，均有促進傷口愈合的作用（Ondua et al.， 2019）。除藥用外，香蒲屬植物在食品、飲料、保健品、材料、肥料、工藝品中也有廣泛應用，而且在水體環(huán)境保護方面，香蒲屬植物具有獨特的應用價值（陳佩東等，2015）。前期開展的江蘇省中藥資源普查過程中發(fā)現(xiàn)，江蘇地區(qū)的香蒲屬植物野生資源量較大，主要以花粉利用為主，但是莖、葉等其他部位的資源化利用并不充分。蒲黃一般在每年6月份采收（嚴華等，2019），由于分布廣泛，地理生態(tài)環(huán)境、采收方式等因素的影響，各地采收的花粉中化學成分的組成存在較大差異，同時，花粉中化學成分的動態(tài)變化規(guī)律也需要深入研究。因此，本課題組首先在江蘇省南京市進行了定點連續(xù)采樣，然后基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對水燭香蒲花粉、莖葉中的化學成分進行定性研究，同時基于HPLC技術(shù)對水燭香蒲不同生長時期花粉和莖葉中3種黃酮類化合物（香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷和異鼠李素）的含量進行定量分析，以期探究香蒲屬植物的資源性化學成分在不同部位的分布情況以及積累的動態(tài)，為香蒲屬植物的資源化學成分的進一步動態(tài)評價及開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 AB SCIEX Triple TOFTM 5600質(zhì)譜儀，電噴霧離子源（ESI）（美國AB SCIEX公司），TF 1.6 Analyst工作站以及Peak View分析軟件，配備LC-20A型液相色譜儀（日本島津公司）。Agilent 1290高效液相色譜儀;Micro CL21R高速冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific）;JY10002電子天平（上海上平儀器有限公司）;掃描電鏡（日本Hitachi S-4800）;420三用恒溫水箱（江蘇金壇國勝實驗儀器廠）;KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;DHG-9023A型電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）;TGL-16C型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.1.2 試劑 對照品：香蒲新苷（批號：Y14S8H43976），異鼠李素-3-O-新橙皮苷（批號：H30M3X1），異鼠李素（批號：P23A9F68614），琥珀酸（批號：B20937），對羥基苯甲酸（批號：MKBK3576V），山奈酚-3-O-葡萄糖苷（批號：Y19M8H36474），異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（批號：S08A8D33447），槲皮素（批號：C09S8Y43412），柚皮素（批號：X21M7C11378），山柰酚（批號：C26J8Y38642）均購自源葉生物科技有限公司。甲醇（色譜純，批號：180975，江蘇漢邦科技有限公司）;乙腈（色譜純，批號：SHBK5734，默克股份有限公司）;磷酸（色譜純，批號：C1801089，阿拉?。?/p>

1.1.3 藥材 蒲黃樣品采集于江蘇省南京市棲霞區(qū)仙林湖（118°58′59.33″ E、32°07′28.38″ N），原植物經(jīng)南京中醫(yī)藥大學中藥資源學教研室嚴輝副教授鑒定為香蒲科植物水燭香蒲（Typha angustifolia）。

1.2 方法

1.2.1 蒲黃樣品采集及前處理 自2019年3月31日起，每隔7天采集一次樣品，至有雄花序后，每2天采集1次花粉。采集的蒲黃莖葉，記錄生長情況。樣品性狀見圖1，樣品株高及基部直徑數(shù)據(jù)見表1。60 ℃恒溫干燥后打粉，過三號篩。蒲黃花粉置紗篩中，保持水平狀態(tài)過篩，除去雜質(zhì)。

花粉在用掃描電鏡拍照前，經(jīng)過如下處理：將花粉粒固定在甲醛溶液（5 mL 38%甲醛、5 mL冰醋酸、90 mL 50% 乙醇和5 mL甘油）中，在24 ℃下，分別用濃度為70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液水合20 min。分別用乙醇和乙酸異戊酯混合溶液（比例為75%∶25%、50%∶50%、25%∶75%和100%乙酸異戊酯）處理20 min，4 h后冷凍干燥（Gao et al.， 2019）。

1.2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析

1.2.2.1 液相色譜條件 Waters ACQUITYTM UPLC HSS T3色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm），流速 0.3 mL·min-1，柱溫 30 ℃，進樣量 4 μL，流動相為0.1%甲酸水溶液（A）（v/v），乙腈（B），梯度洗脫為0～10 min，15% B;10～15 min，15%～30% B;15～25 min，30%～50% B;25～28 min，50%～15% B;28～30 min，15%（Ding et al.， 2018）。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），分別在正負離子模式下采集。主要參數(shù)設置如下：噴霧電壓（IS）：4 500 V，離子源溫度（TEM）：550 ℃，氣簾氣（Curtain Gas）：40 psi，霧化器（GS1）：55 psi，輔助加熱器（GS2）：55 pis，周期時間：1 300 ms，去簇電壓（DP）：-100 V，碰撞能量（CE）：-40 V，脈沖頻率：15.420 kHz，質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z 50～1 500。

1.2.2.3 供試品溶液制備 精密稱定2019年6月15日所采集蒲黃花粉和莖葉干燥粉末各1.0 g，于100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL超聲提取45 min。待其冷卻后補足甲醇超聲過程中減少的重量，吸取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜進行過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.3 水燭香蒲不同部位的黃酮類成分含量測定

1.2.3.1 供試液的制備 取樣品約0.5 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，冷浸12 h后加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.3.2 對照液的制備 精密稱取香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、異鼠李素適量，分別加甲醇10 mL制成香蒲新苷濃度為48.51 μg·mL-1，異鼠李素-3-O-新橙皮苷濃度為30.97 μg·mL-1，異鼠李素濃度為3.23 μg·mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 色譜分析條件 色譜柱為PRAZIS C18 （250 mm × 4.6 mm，5 μm，LOT：PA181711）;流動相為乙腈（B）-0.05%磷酸（A）;柱溫30 ℃;流速1.0 mL·min-1;進樣量10 μL;梯度洗脫條件為0～5 min，95.0%～86.0% A;5～10 min，86.0%～68.0% A;10～15 min，68.5% A;15～40 min，68.5%～55.0% A;40～43 min，55.0%～95.0% A;43～46 min，95.0% A（Gao et al.， 2019）。色譜峰與臨近峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)不低于5 000，具體見圖2。

1.2.3.4 線性關(guān)系 精密吸取1.2.3.2項下對照品溶液逐級稀釋，香蒲新苷（48.51、24.25、12.13、6.06、3.03、1.52 μg·mL-1）、異鼠李素-3-O-新橙皮苷（30.97、15.48、7.74、3.87、1.94、0.97、0.48 μg·mL-1）、異鼠李素（3.23、1.62、0.81、0.40、0.20、0.10、0.05 μg·mL-1），分別精密吸取10 μL，按照上述色譜條件分析。以對照品濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸;分別以信噪比S/N=3，10為基準計算檢測限（LOD），定量限（LOQ）。結(jié)果得到香蒲新苷的回歸方程：Y=10.998X-1.216，r=0.999 9;異鼠李素-3-O-新橙皮苷的回歸方程：Y=13.599X+0.374 8，r=0.999 9;異鼠李素的回歸方程：Y=53.763X-0.464 2，r=

0.999 8。各對照品在該濃度范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷及異鼠李素的檢測限分別為0.126 3、0.379 0、0.242 0 μg·mL-1，定量限分別為0.322 6、0.025 3、0.033 7 μg·mL-1。

1.2.3.5 精密度試驗 精密吸取1.2.3.2項下同一份對照品溶液10 μL，在上述色譜條件下重復進樣6次，計算各峰面積的相對標準偏差（RSD）考察儀器的精密度。測得香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.31%、1.53%、1.17%，表明儀器的精密度良好。

1.2.3.6 重復性試驗 精密稱取同一批蒲黃花粉樣品，按1.2.3.2項下制備方法制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進樣，測得香蒲新苷平均含量3.372 0 mg·g-1，RSD為1.36%;異鼠李素-3-O-新橙皮苷平均含量2.402 1 mg·g-1，RSD為1.28%;異鼠李素平均含量0.006 2 mg·g-1，RSD為1.33%，表明該方法重復性良好。

1.2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取1.2.3.2項下的同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h按上述色譜條件進樣，每次10 μL。測得香蒲新苷峰面積的RSD為0.55%，異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積的RSD為0.56%，異鼠李素峰面積的RSD為1.94%，表明對照品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.3.8 加樣回收試驗 精密稱取同一批蒲黃花粉6份，每份約0.25 g，分別精密加入1.2.3.2項下已知含量的對照品溶液，按1.2.3.1項下的制備方法制備后，在上述色譜條件下進樣，具體數(shù)據(jù)見表2。測得香蒲新苷平均回收率為96.77%，RSD為2.67%;異鼠李素-3-O-新橙皮苷平均回收率為95.35%，RSD為1.10%;異鼠李素平均回收率為99.89%，RSD為2.89%，表明該方法的回收率較好。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲黃樣品性狀及生長情況

采集的樣品及花粉性狀見圖1，樣品株高及基部直徑數(shù)據(jù)見表1。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS結(jié)果分析

水燭香蒲莖葉及花粉樣品所得UPLC-Q-TOF-MS總離子流圖見圖2。由圖2可知，大多數(shù)化合物能在花粉和莖葉中分別觀察到，但不同部位的總離子流圖譜還是存在明顯差異，說明這些部位的化合物種類和含量有所不同。

高分辨質(zhì)譜所得數(shù)據(jù)，經(jīng)Peak View分析軟件分析，根據(jù)準分子離子峰、碎片離子峰分析，結(jié)合已知化合物以及文獻對照， 初步解析了水燭香蒲花粉及莖葉中所含的42個化合物。結(jié)果見表3。

水燭香蒲UPLC-Q-TOF-MS的定性分析共鑒定42個化合物，包括27個黃酮類成分，11個有機酸類成分，2個腺苷類成分，1個氨基酸以及1個聚酮類化合物。以往研究表明，尿苷在質(zhì)譜中，容易脫去一分子核糖，從而生成m/z 110的碎片峰，我們的實驗結(jié)果與文獻一致（毛豐等，2014）。蘆葦醇C的母核為聚酮類化合物（Enomoto et al.， 2006），質(zhì)譜中出現(xiàn)了脫羧基、脫水以及側(cè)鏈斷裂的裂解碎片峰m/z 97（圖3）。

香豆酸母離子m/z 163的二級譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 119，由母離子丟失一個CO2形成（ [M-44]-）的碎片離子峰（李磊等，2012）。其他的有機酸如檸檬酸、琥鉑酸等在電噴霧質(zhì)譜中也容易脫去羧基，在此基礎上進一步生成脫水的碎片離子峰（曾凱等，2019）。在本實驗中，可以觀察到無論芳香有機酸還是脂肪酸，都出現(xiàn)了脫羧基或脫水的碎片離子峰，具體見圖4。

水燭香蒲中富含黃酮類化合物，苷元主要是異鼠李素、山柰酚、槲皮素等。在負離子模式下，黃酮苷類能得到較好的準分子離子峰，但在正離子模式下，能觀察到較多的碎片離子峰，其中主要是苷鍵裂解碎片離子。如香蒲新苷，在正離子模式下可觀察到三個糖苷鍵裂解的碎片峰（圖5：A）。兒茶素和表兒茶素，經(jīng)過A環(huán)或B環(huán)的裂解，容易得到m/z 245和m/z 205的碎片離子（圖5：B）。而原兒茶酸m/z 153的二級譜圖中最主要的碎片離子峰為m/z 109，由母離子丟失一個CO2 （ [M-44]-）所形成（劉國強等，2009;馬悅等，2017）。

異鼠李素-3-O-新橙皮苷及異鼠李素-3-O-蕓香糖苷均為異鼠李素-3-O-糖苷，是同分異構(gòu)體，二者均裂解出m/z 479和m/z 317的碎片離子峰。在實驗中，觀察到異鼠李素-3-O-蕓香糖苷的苷元更容易裂解成小碎片峰，與文獻報道一致（Su et al.， 2010），具體見圖6。

研究表明，槲皮素-7-O-糖苷，容易出現(xiàn)丟失葡萄糖基（M-162 Da）而生成Y-0（m/z 301）的碎片離子峰，但不易出現(xiàn) [Y0-H]-離子（m/z 300）（Gegn， 2007）。本實驗中，在碰撞能量（CE）為-40 V的條件下，槲皮素-3-O-（2G-α-L-鼠李糖基）-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等化合物均觀察到m/z 300的碎片離子峰，表明糖基沒有連接在槲皮素苷元的7位羥基上，而3位和7位同時有糖苷鍵的蘆丁卻能觀察到m/z 301.000 4的碎片離子峰。

2.3 蒲黃樣品含量測定

各樣品按1.2.3.1項下供試品制備方法制備，按上述方法測定，進樣量為10 μL，注入液相色譜儀，測定。HPLC圖譜見圖7，檢測結(jié)果見圖8。結(jié)果表明，莖葉和花粉中均可檢出異鼠李素和異鼠李素-3-O-新橙皮苷，但是含量以及時間有一定差異。6月后花粉中方可檢測到這兩種成分，并呈現(xiàn)出上升趨勢。花粉中異鼠李素含量低于莖葉，而異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量高于莖葉。

3 討論與結(jié)論

蒲黃為中醫(yī)臨床常用藥物，來源于香蒲屬植物花粉， 《本草分經(jīng)》中即有蒲黃 “生用性滑，行血消瘀，炒黑性澀止血”的記載，在中醫(yī)臨床上是非常重要的藥物（Wang et al.， 2020）。香蒲屬植物作為多年生水生植物，其莖葉中成分除了具有抗癌等活性（Sorourian et al.， 2020），還可吸收池塘、湖泊中由于工業(yè)、農(nóng)業(yè)排放的重金屬及氮磷有機污染物，起到凈化水體的作用（Hadad et al.， 2018;Di et al.， 2019）。香蒲植物莖葉生長期長且生物量較大，有較高的開發(fā)價值，但目前對香蒲植物莖葉的化學成分研究報道較少，資源綜合利用極不充分，甚至出現(xiàn)由于采收花粉成本較高而放棄藥用資源蒲黃的現(xiàn)象。通過UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對南京地區(qū)水燭香蒲的花粉和莖葉進行定性鑒別，并對不同生長期、不同部位的樣品中香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷及異鼠李素進行定量分析，研究了香蒲植物生長過程中體內(nèi)化學成分差異及累積過程規(guī)律，為充分開發(fā)和利用香蒲藥用資源提供理論依據(jù)。

研究結(jié)果顯示：水燭香蒲花粉和莖葉中共分析鑒定出42個化學成分，其中有8個化合物在不同部位中有差異。異鼠李素-3-O-新橙皮苷及異鼠李素在香蒲的發(fā)育生長過程中含量變化規(guī)律類似，都呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，特別是臨近雄花序的長出，莖葉內(nèi)的這兩種成分含量下降明顯。在花粉中，香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量急劇上升，一周內(nèi)達到峰值，而異鼠李素在花粉中含量更低。值得注意的是6月15日后，由于風雨天氣頻發(fā)，容易造成花粉大量損失，所以花粉采收的時間應在雄花序長出一周內(nèi)完成。異鼠李素是一種常見的化學成分，但異鼠李素-3-O-新橙皮苷并不常見，而香蒲新苷更是只存在于少量的植物中（Tai et al.， 2010）。研究結(jié)果顯示，香蒲新苷在莖葉中含量較低，大多數(shù)樣品中均未檢出，而花粉中擁有較高含量的香蒲新苷，這可能與香蒲屬植物體內(nèi)的酶定向催化有關(guān)。本研究對水燭香蒲中黃酮類成分的含量變化規(guī)律以及花粉、莖葉中的化合物進行了定性、定量分析，為香蒲屬植物資源的綜合利用和蒲黃合理采收提供了科學依據(jù)。

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（責任編輯 周翠鳴）