不同粗飼料組合對(duì)晉南牛瘤胃體外發(fā)酵特性的研究

張丹丹，張?jiān)獞c，程景，靳光，李博，王棟才，徐芳，孫銳鋒

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太原030032）

近年來(lái)，我國(guó)居民牛肉消費(fèi)量穩(wěn)步增加，消費(fèi)者對(duì)牛肉品質(zhì)提出更高的要求，但牛肉產(chǎn)量與消費(fèi)需求的缺口在逐年加大。分析原因，牛種資源未得到充分利用是制約我國(guó)牛肉產(chǎn)量的重要因素。山西特色牛種晉南牛是我國(guó)五大良種黃牛之一，具有飼料利用率和屠宰率高，產(chǎn)肉性能佳、肉質(zhì)鮮美的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，山西省的飼料資源豐富，在國(guó)家推行“糧改飼”政策后，朔州市大力推廣種植全株青貯玉米（Zea mays）和苜蓿（Medicago sativa）。全株玉米青貯和苜蓿青貯也因其營(yíng)養(yǎng)成分高，消化率高、適口性好、耐貯存等優(yōu)點(diǎn)，成為反芻動(dòng)物重要的優(yōu)質(zhì)粗飼料來(lái)源［1?2］。小麥（Triticum aestivum）是山西省主要糧食作物之一，全省常年種植小麥大約6670 hm2，但因小麥秸稈營(yíng)養(yǎng)價(jià)值含量低、口感粗糙，利用率不高，造成大量飼料資源浪費(fèi)。利用特色飼料資源發(fā)展優(yōu)勢(shì)牛種，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛肉，不僅可以提高秸稈利用率，而且可以促進(jìn)山西肉牛產(chǎn)業(yè)新發(fā)展。

為提高利用率，現(xiàn)在越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始研究飼料組合利用效應(yīng)，通過(guò)不同比例組合，提高飼料的利用率。一般來(lái)說(shuō)，飼料組合間會(huì)存在互作效應(yīng)而且不同的飼料組合其互作效應(yīng)也不同［3］，適宜的比例組合會(huì)產(chǎn)生正組合效應(yīng)。韓肖敏等［4］利用體外產(chǎn)氣法篩選出玉米秸稈、稻草、玉米秸稈青貯正組合效應(yīng)組合比例，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了玉米秸稈、稻草、玉米秸稈青貯與精料的最佳組合比例。馬吉鋒等［5］研究不同粗飼料組合的體外發(fā)酵結(jié)果。周芯宇等［6］比較了不同類(lèi)型酒糟與稻草、燕麥（Avena sativa）干草以不同比例組合后的發(fā)酵結(jié)果。

本試驗(yàn)旨在利用體外產(chǎn)氣法研究全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯間以不同比例組合對(duì)晉南牛瘤胃發(fā)酵特性的影響，篩選不同飼料的最適比例，提高飼料秸稈利用率，為解決飼料供應(yīng)不足以及擴(kuò)大飼料來(lái)源提供參考，同時(shí)促進(jìn)優(yōu)勢(shì)牛種利用，推動(dòng)山西肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018 年6 月在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所試驗(yàn)基地（山西省臨汾市堯都區(qū)，東經(jīng)111.52°，北緯36.11°）采割蠟熟期小麥秸稈，此時(shí)小麥秸稈含水率40.73%。2018 年9 月，課題組于朔州基地制作全株玉米青貯，在玉米乳熟期收割全株玉米，將其切短至2 cm 后，裝桶、封嚴(yán)等，制成青貯，發(fā)酵45 d 開(kāi)桶，苜蓿青貯采集于朔州試驗(yàn)牛場(chǎng)。采集飼料樣品65 ℃烘干，粉碎，過(guò)篩（0.425 mm），制成試樣。3 種飼料樣品的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Nutrients of whole plant corn silage，wheat straw and alfalfa silage

1.2 瘤胃液采集

瘤胃液取自4 頭裝有瘤胃瘺管的晉南牛。在試驗(yàn)當(dāng)天晨飼前采集瘤胃液1000 mL，置于預(yù)先通有CO2的保溫瓶中，蓋嚴(yán)瓶口后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。將瘤胃液混合均勻后經(jīng)4 層紗布過(guò)濾，置于39 ℃水浴中保存，并持續(xù)充入CO2以確保瘤胃液處于厭氧環(huán)境。

1.3 體外發(fā)酵試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將全株玉米青貯、小麥秸稈、苜蓿青貯以不同比例組合作為發(fā)酵底物（表2），每個(gè)組合3 次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置3 個(gè)空白對(duì)照（培養(yǎng)管不加任何發(fā)酵底物），校正產(chǎn)氣量。按照Menke 等［7］介紹的方法配置緩沖液后，持續(xù)通入CO2并預(yù)熱至39 ℃。將采集的晉南牛瘤胃液與緩沖液以1∶2 混合制成人工瘤胃培養(yǎng)液，通入CO2至飽和，39 ℃恒溫水浴。

表2 全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯不同比例組合Table 2 Different proportion of whole plant corn silage，wheat straw and alfalfa silage

準(zhǔn)確稱(chēng)量0.22 g 發(fā)酵底物送至100 mL 培養(yǎng)管的前端，加入30 mL 人工瘤胃培養(yǎng)液后（空白管只加人工瘤胃培養(yǎng)液），在水浴恒溫振蕩器中反應(yīng)，發(fā)酵72 h后，冷水終止發(fā)酵。將培養(yǎng)管中發(fā)酵液排出至50 mL離心管中，離心（4 ℃，5400 r·min?1，15 min），上清液分裝至3 個(gè)2 mL 離心管中，置于?80 ℃冰箱保存，用于揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）和氨態(tài)氮（NH3-N）等指標(biāo)測(cè)定。多次清洗殘?jiān)螅?5 ℃烘干，測(cè)定體外干物質(zhì)降解率（in vitrodry matter degradation rate，IVDMD）。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 產(chǎn)氣量（gas production，GP）的測(cè)定及產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)模型分析 分別在 2、4、8、12、24、36、48、72 h記錄相應(yīng)產(chǎn)氣量，GPt=（Vt樣?V0樣）?（Vt空?V0空）。式中：GPt，樣品在t時(shí)刻的產(chǎn)氣量（mL）；Vt樣，樣品發(fā)酵t小時(shí)后培養(yǎng)管的刻度；V0樣，樣品在開(kāi)始發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)管刻度；Vt空，空白管發(fā)酵t小時(shí)后培養(yǎng)管的刻度；V0空，空白管在開(kāi)始發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)管的刻度。

采用體外發(fā)酵模型GP=b［1?e?c（t?Lag）］［8］計(jì)算產(chǎn)氣參數(shù)。式中：GP為t時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量（mL·g?1DM）；b為理論最大產(chǎn)氣量（mL·g?1DM）；c為產(chǎn)氣速度（mL·h?1）；t為體外培養(yǎng)時(shí)間（h）；Lag為延滯期（h）。

1.4.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定 采用pH 酸度計(jì)（S-25，上海）測(cè)定pH，堿性次氯酸鈉?苯酚分光光度計(jì)（T2602，上海）［9］測(cè)定氨態(tài)氮（NH3-N）含量，利用氣相色譜儀（Aglient 7890A，美國(guó)）測(cè)定VFA［10］濃度，總揮發(fā)性脂肪酸（total volatile fatty acid，TVFA）為乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸之和。

1.4.3 體外干物質(zhì)降解率（IVDMD）的測(cè)定IVDMD（%）=100×［發(fā)酵底物干物質(zhì)含量?（樣品殘?jiān)晌镔|(zhì)含量?空白管殘?jiān)晌镔|(zhì)含量）］/發(fā)酵底物干物質(zhì)含量

1.4.4 組合效應(yīng)計(jì)算 單項(xiàng)組合效應(yīng)值（single-factor associative effects index，SFAEI）和綜合組合效應(yīng)值（multiple-factor associative effects index，MFAEI）計(jì)算方法如下：

單項(xiàng)組合效應(yīng)值=（實(shí)測(cè)值?加權(quán)估算值）/加權(quán)估算值，加權(quán)估算值=A 飼料實(shí)測(cè)值×A 飼料配比（%）+B飼料實(shí)測(cè)值×B 飼料配比（%）［11］。

綜合效應(yīng)值為各單項(xiàng)組合效應(yīng)值之和。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2016 整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 21.0 進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s 多重比較及非線性參數(shù)模擬。P＜0.01 為差異極顯著，P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯對(duì)產(chǎn)氣量的影響

由表3 可知，各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯的組合比例對(duì)產(chǎn)氣量的影響極顯著（P＜0.01）。各組的產(chǎn)氣量均隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，且72 h 產(chǎn)氣量隨著全株玉米青貯比例增加而增加。組合100∶0∶0 和 80∶10∶10 的 72 h 產(chǎn)氣量顯著高于其他組合（P＜0.05），60∶10∶30（P＞0.05）和 60∶20∶20（P＜0.05）組產(chǎn)氣量高于 60∶30∶10 組，50∶10∶40 組產(chǎn)氣量顯著高于 50∶20∶30、50∶30∶20、50∶40∶10 組（P＜0.05）。當(dāng)組合中苜蓿青貯比例固定時(shí)，隨著全株玉米青貯比例增加，體外產(chǎn)氣模擬參數(shù)b數(shù)值增加。全株玉米青貯和苜蓿青貯產(chǎn)氣速度最高（0.135 和 0.130 mL·h?1），其次為 60∶10∶30 組（0.127 mL·h?1），小麥秸稈產(chǎn)氣速度最低（0.047 mL·h?1）。

表3 不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯對(duì)產(chǎn)氣量的影響Table 3 Effects of different proportion of whole plant corn silage，wheat straw and alfalfa silage on GP

2.2 不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯對(duì)體外發(fā)酵指標(biāo)的影響

發(fā)酵72 h，各組體外發(fā)酵液pH 保持為6.68～6.89（P＜0.01）（表4）。氨態(tài)氮的變化范圍為14.31～26.01 mg·100 mL?1（P＜0.01）。氨態(tài)氮含量隨著苜蓿青貯比例增加而增加，60∶10∶30 組氨態(tài)氮含量高于60∶20∶20、60∶30∶10 組（P＞0.05），50∶10∶40 組氨態(tài)氮含量高于 50∶20∶30、50∶30∶20、50∶40∶10 組（P＞0.05）。IVDMD 以100∶0∶0 組顯著高于其他組（P＜0.05），其次為70∶20∶10、80∶10∶10、70∶10∶20 組，且三者差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)組合中全株玉米青貯比例為60 和50 時(shí)，隨著苜蓿青 貯 比 例 增 加 ，IVDMD 增 加 。 50∶10∶40 組 中IVDMD 顯 著 高 于 50∶20∶30、50∶30∶20、50∶40∶10 組（P＜0.05）。 60∶10∶30、60∶20∶20、60∶30∶10 組 間IVDMD 差異不顯著（P＞0.05）。

表4 不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯對(duì)體外發(fā)酵指標(biāo)的影響Table 4 Effects of different proportion of whole plant corn silage，wheat straw and alfalfa silage on fermentation index in vitro

2.3 不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯對(duì)VFA 濃度的影響

不同比例組合的全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯的組合比例對(duì)體外發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的濃度影響極顯著（P＜0.01）。60∶30∶10 組乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著高于其他各組（P＜0.05），其丙酸濃度也為最高（13.99 mmol·L?1）。70∶10∶20組的丁酸濃度最高，與 80∶10∶10、60∶10∶30、60∶30∶10、50∶20∶30、50∶30∶20 組差異不顯著（P＞0.05）。乙 酸/丙 酸 在 2.76～3.20，組 間 差 異 不 顯 著（P＞0.05）（表 5）。

表5 不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯對(duì)體外發(fā)酵液VFA 濃度的影響Table 5 Effects of different proportion of whole plant corn silage，wheat straw and alfalfa silage on VFA

2.4 不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯組合效應(yīng)

不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯組合效應(yīng)值見(jiàn)表6，50∶10∶40 產(chǎn)氣量出現(xiàn)正組合效應(yīng)，其余比例組合產(chǎn)氣量均為負(fù)組合效應(yīng)。80∶10∶10、60∶30∶10、50∶40∶10 組的IVDMD 為負(fù)組合效應(yīng)，其余比例均為正組合效應(yīng)，50∶10∶40 組正組合效應(yīng)最大。pH 各組均為正組合效應(yīng)，60∶20∶20 組的 NH3-N 正組合效應(yīng)最大。不同組合的綜合組合效應(yīng)值均為正組合效應(yīng)，70∶20∶10 綜合組合效應(yīng)值（0.9343）最高。

表6 不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯組合效應(yīng)Table 6 Associative effect of different proportion of whole plant corn silage，wheat straw and alfalfa silage

3 討論

3.1 不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯對(duì)產(chǎn)氣量的影響

飼料中碳水化合物和粗蛋白在瘤胃發(fā)酵液作用下產(chǎn)生氣體CO2和CH4，當(dāng)產(chǎn)氣量越高，表明飼料的可發(fā)酵物質(zhì)含量越高，瘤胃微生物活性越高［12］。各組合的產(chǎn)氣量均隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加。全株玉米青貯的產(chǎn)氣量顯著高于小麥秸稈和苜蓿青貯。全株玉米青貯、苜蓿青貯和小麥秸稈組合后產(chǎn)氣量雖有提高，但是仍低于全株玉米青貯，隨著全株玉米青貯比例增加，組合的72 h 產(chǎn)氣量表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，與全株玉米青貯飼料含有易于發(fā)酵的可溶性碳水化合物有關(guān)。50∶10∶40 組產(chǎn)氣量高于60∶30∶10 組，可能是不同飼料組合后，碳水化合物與蛋白質(zhì)比例發(fā)生變化，影響飼料的發(fā)酵能力，導(dǎo)致不同比例組合間的產(chǎn)氣規(guī)律發(fā)生變化［11］。全株玉米青貯產(chǎn)氣量最高，其IVDMD 也為最高，有研究表明，產(chǎn)氣量與IVDMD 呈正相關(guān)［13］。各組合結(jié)果中，產(chǎn)氣量和IVDMD 規(guī)律略有差異，但趨勢(shì)一致。分析體外模擬參數(shù)結(jié)果，苜蓿青貯產(chǎn)氣速度高，延滯期短，理論最大產(chǎn)氣量卻低于小麥秸稈，可能與苜蓿青貯發(fā)酵初期速度較快，但隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，微生物能量供應(yīng)不足，發(fā)酵潛力小，而小麥秸稈纖維結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量高，屬于慢速發(fā)酵飼草類(lèi)型，但發(fā)酵潛力略高于苜蓿青貯。

3.2 不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響

瘤胃液pH 的變化可以反映瘤胃內(nèi)部環(huán)境與微生物的發(fā)酵水平。瘤胃微生物最適生長(zhǎng)pH 在6.6～7.0［14］。本試驗(yàn)中，飼料組合比例對(duì)pH 影響極顯著，但是飼料單樣和各比例組合的體外發(fā)酵培養(yǎng)液的pH 均保持在6.68～6.89，適合瘤胃微生物生長(zhǎng)。

氨態(tài)氮的變化范圍為 14.31～26.01 mg·100 mL?1，與吳璇等［15］的研究結(jié)果一致（19.21～29.77 mg·100 mL?1），在瘤胃微生物最適生長(zhǎng)范圍之內(nèi)（6.30～27.50 mg·100 mL?1）［16?17］。體外發(fā)酵產(chǎn)生的氨態(tài)氮主要來(lái)源是微生物對(duì)含氮物質(zhì)的降解，生成的氨態(tài)氮一部分用于合成微生物蛋白，一部分溶解在發(fā)酵液中。苜蓿青貯的氨態(tài)氮含量顯著高于全株玉米青貯和小麥秸稈。且當(dāng)全株玉米青貯比例固定時(shí)，苜蓿青貯比例增加，氨態(tài)氮含量增加，這與苜蓿青貯蛋白含量（19.41%）遠(yuǎn)高于小麥秸稈（5.45%）有關(guān)。70∶20∶10 組氨態(tài)氮含量略高于苜蓿青貯，說(shuō)明飼料組合之間發(fā)生互作效應(yīng)。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的含量會(huì)影響瘤胃微生物對(duì)氨態(tài)氮的利用，飼料單樣中全株玉米青貯的氨態(tài)氮含量最低，組合后氨態(tài)氮含量增加，組合相應(yīng)降低了非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量，影響了其對(duì)氨態(tài)氮的利用，這與涂瑞等［18］的研究結(jié)果一致。

除去全株玉米青貯，當(dāng)全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯的比例為70∶20∶10 時(shí)，其IVDMD 最高。IVDMD 可反映飼料的可利用性，同時(shí)也可用來(lái)衡量飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。全株玉米青貯的IVDMD 顯著高于苜蓿青貯和小麥秸稈，同全株玉米青貯中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量較高，可發(fā)酵成分含量高的規(guī)律一致。小麥秸稈和苜蓿青貯的IVDMD 顯著低于其他組合，而當(dāng)組合中全株玉米青貯比例為60 和50 時(shí)，苜蓿青貯比例增加也會(huì)增加組合的IVDMD。全株玉米青貯和苜蓿青貯組合后，組合中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量相應(yīng)提高，碳氮比趨于最佳，更容易被微生物利用。

反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸（VFA）主要來(lái)源于日糧中碳水化合物的降解，其是瘤胃微生物維持和生長(zhǎng)的主要能量來(lái)源。揮發(fā)性脂肪酸濃度的高低反映了飼料碳水化合物的降解程度，揮發(fā)性脂肪酸的含量及比例也是反映瘤胃發(fā)酵類(lèi)型的重要指標(biāo)之一。底物中粗飼料比例越高，發(fā)酵產(chǎn)生乙酸含量越高，乙酸/丙酸越高［11］。本試驗(yàn)中各組合結(jié)果都為乙酸含量高于丙酸，以粗飼料發(fā)酵類(lèi)型為主。有研究表明，乙酸/丙酸范圍應(yīng)為2.0～3.6，其比值變化會(huì)受到動(dòng)物、飼料及飼養(yǎng)條件等因素的影響［19］。本試驗(yàn)乙酸/丙酸在2.76～3.20，飼料以不同比例組合后，營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化同時(shí)降低了乙酸/丙酸的比值。

3.3 不同比例全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯組合效應(yīng)分析

本試驗(yàn)中，單一組合效應(yīng)值結(jié)果與綜合組合效應(yīng)值結(jié)果略有差異，多項(xiàng)研究表明，結(jié)合多項(xiàng)指標(biāo)對(duì)組合效應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)定，結(jié)果更為客觀準(zhǔn)確［11，19?21］。結(jié)合產(chǎn)氣量、體外干物質(zhì)降解率、pH、氨態(tài)氮、總揮發(fā)性脂肪酸計(jì)算的綜合組合效應(yīng)值各組均為正值，說(shuō)明組合后各飼料間發(fā)生正組合效應(yīng)，提高了組合的整體發(fā)酵能力，促進(jìn)了飼料利用［20，22］。在本試驗(yàn)條件下，全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯以70∶20∶10 組合時(shí)，其綜合組合效應(yīng)值（0.9343）最高。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，當(dāng)全株玉米青貯、小麥秸稈和苜蓿青貯比例為70∶20∶10 時(shí)，組合效應(yīng)最佳。