基于BSA-SSR 技術(shù)的高丹草低氫氰酸性狀目的片段的篩選與鑒定

吳國芳，于肖夏，于卓，楊東升，盧倩倩

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010019）

高丹草（Sorghum bicolor×Sorghum sudanense）為高粱（Sorghum bicolor）與蘇丹草（Sorghum sudanense）種間雜交育成的品種（2n=2x=20）［1?2］。其具有生長速度快、分蘗數(shù)多、再生性強、抗寒、抗旱、耐倒伏、產(chǎn)草量高、品質(zhì)好等優(yōu)點［3?5］，可多次青刈飼喂家畜，亦可青貯及調(diào)制優(yōu)質(zhì)青干草，是我國農(nóng)區(qū)及半農(nóng)半牧區(qū)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要一年生優(yōu)良飼草［6］。但幼嫩的高丹草含有一定量的氫氰酸，家畜采食過量后，可引起中毒現(xiàn)象［7?9］。因此，急需培育低氫氰酸含量、飼喂家畜安全的高丹草新品種。

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR），亦稱微衛(wèi)星DNA 標記，其均勻分布在植物基因組中［10］。SSR標記呈共顯性遺傳，可鑒別純合子和雜合子、多態(tài)性好、對DNA 質(zhì)量要求不高且用量少，目前已成功應(yīng)用于作物品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀QTL 定位及標記輔助育種等研究［11?14］。群體分離分析法（bulked segregation analysis，BSA）即DNA 混池法，由Michelmore 等［15］1991 年首次提出。該方法是利用具有一定表型差異的親本雜交產(chǎn)生后代分離群體單株，建立具有目標性狀的兩個極端DNA 基因池，進行相關(guān)性狀的分子標記篩選，若在2 個極端DNA 基因池之間存在一定的多態(tài)性分子標記差異，則表明該標記與目標性狀基因呈連鎖遺傳［16］。目前，國內(nèi)外學者將BSA 法與SSR 分子標記相結(jié)合，已成功應(yīng)用于小麥（Triticum aestivum）根部線蟲抗性基因片段［17］及水稻（Oryza sativa）葉枯?。?8］、甘蔗（Saccharum officinarum）褐銹?。?9］、高粱粒重［20］等性狀的基因片段篩選，而在高丹草低氫氰酸含量性狀相關(guān)基因片段的篩選尚未見有研究報道。

本課題組前期以氫氰酸含量較高的散穗高粱（scattered ear sorghum）作母本，氫氰酸含量較低的紅殼蘇丹草（red hull sudangrass）作父本，通過人工去雄雜交成功獲得高丹草F1代植株，進而將F1代套袋自交獲得F2代分離群體［21?22］。本試驗以高丹草F2分離單株群體及其親本為材料，通過測定氫氰酸含量篩選出高氫氰酸含量植株和低氫氰酸含量植株，構(gòu)建DNA 基因池，利用BSA?SSR 法篩選與高丹草低氫氰酸含量性狀相關(guān)的SSR?DNA 目的片段，并對其進行回收、純化和測序，以期鑒定出高丹草低氫氰酸含量性狀的相關(guān)基因片段，為下一步低氫氰酸性狀主效QTL 精細定位、基因圖位克隆及其功能解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及種植

材料為高丹草F2分離群體及其親本散穗高粱和紅殼蘇丹草。2020 年5 月種植在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場，行距為50 cm，株距為25 cm。生長期內(nèi)根據(jù)生長狀況及時施肥、灌水，保證植株對養(yǎng)分和水分的需求，并注意防除田間雜草。

1.2 研究方法

1.2.1 氫氰酸含量測定 在高丹草拔節(jié)期，株高約為100 cm 時，田間剪取F2代500 個分離單株及親本的新鮮莖葉，按單株用微型粉碎器粉碎混勻，每個樣品分別稱取1.0 g，放入裝有8 滴甲基橙、10 mL 硝酸鋅和270 mL 蒸餾水的500 mL 蒸餾瓶中加熱蒸餾。用裝有10 mL 1.0% NaOH 吸收液的100 mL 容量瓶收集餾出液，當容量瓶中的餾出液為100 mL 時，蒸餾結(jié)束。吸取10 mL 餾出液放入25 mL 容量瓶中，加入5 mL 磷酸鹽緩沖液和4 滴1.0%的氯胺T，充分搖勻3 min，然后加入5 mL 異煙酸?吡唑啉酮比色酸（5∶1 混合物）進行顯色處理［23］，用日本島津公司產(chǎn)紫外分光光度計UV-1800 在636.5 nm 處比色測定樣液的吸光度值y，每個樣品重復(fù)測定3 次。以CN?濃度（μg·mL?1）為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.1078x?0.0019（R2=0.9999）。方程中y為吸光度，x為 CN?的質(zhì)量濃度，計量單位換算成 mg·kg?1FW［7］。

1.2.2 DNA 提取與DNA?BSA 混池建立 本試驗用植物基因組DNA 提取試劑盒提取F2低氫氰酸含量（＜15 mg·kg?1FW，簡稱低氰）和高氫氰酸含量（＞300 mg·kg?1FW，簡稱高氰）的極端單株各10 株及母本散穗高粱和父本紅殼蘇丹草的DNA。從極端株中各吸取5 μL 的DNA 進行等量混合，形成低氰基因池和高氰基因池。

1.2.3 SSR 引物設(shè)計與PCR 擴增 試驗所用70 對SSR 引物是根據(jù)已公布的高粱基因組EST 序列，借助SSR Hunter 軟件查找SSR 位點，利用Primer 5 軟件設(shè)計出SSR 引物序列，委托南京金瑞斯生物科技有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系總體積為 20 μL。其中含 Mg2+的 10×buffer 2.0 μL，2.5 mmol·L?1的 dNTP 1.5 μL，5 U·μL?1的Taq-poLymerase 0.2 μL，10 ng·μL?1上下游引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，ddH2O 補足 20 μL。

PCR 擴增程序：循環(huán)前 94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，38 個循環(huán)。循環(huán)后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，加入 5.0 μL 變性劑，95 ℃變性 5 min，迅速取出在冰上冷卻，置于?20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 電泳及膠板銀染 將上述PCR 變性后的樣品取5 μL，用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物的質(zhì)量。電泳緩沖液為1×TBE，恒定功率70 W，電泳時長1.2 h。電泳后對膠板進行銀染，參照李建武等［24］的染色方法。

1.2.5 低氰DNA 目的片段的回收與純化 以母本散穗高粱SSR?DNA 片段為高氰參比，以紅殼蘇丹草SSR?DNA 片段為低氰參比，用100 bp 的LadderDNA 作Marker，在電泳膠板上找出低氫氰酸含量的DNA 片段進行回收。在聚丙烯酰胺凝膠電泳膠板上分別用無菌手術(shù)刀將不同SSR 引物擴增出的單一低氰目的片段條帶切下，置1.5 mL 離心管中，加入0.2 mL ddH2O，用槍頭將膠塊充分碾碎，加蓋后將離心管置入100 ℃沸水中加熱10 min，釋放凝膠內(nèi)的DNA。冷卻2 min 后，4 ℃下12000 r·min?1離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中。

1）低氰目的片段二次PCR 擴增及電泳檢測。將以上得到的上清液用原PCR 體系和程序進行再次擴增，產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（電壓120 V，電泳25 min）。若電泳結(jié)果顯示清晰的單一條帶，且分子量大小與聚丙烯酰胺凝膠中的低氰條帶相對應(yīng)，則表明回收質(zhì)量較好；若瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示的條帶在2 條以上，則表明目的片段回收質(zhì)量較差，需進一步純化。

2）目的片段純化。用索萊寶公司生產(chǎn)的PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，依據(jù)說明書對2 條以上低氰目的片段的DNA進行純化。

3）目的片段命名。采用目的片段（target fragment）的英文縮寫“TF”+“片段數(shù)目”，如TF1。

1.2.6 純化DNA 檢測 吸取純化得到的DNA 片段溶液5 μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若低氰DNA 目的片段呈清晰單一條帶，則達到測序要求。

1.2.7 低氰DNA 目的片段的測序及序列比對 委托上海生物工程股份有限公司對篩選出的高丹草低氰DNA 目的片段進行測序。將測序獲得的低氰目的片段序列，與GenBank（http//：www. ncbi. nLm. nih. gov/BLAST/）和高粱基因組數(shù)據(jù)庫V3.1.1（http：//www.gramene.org/Sorghum_bicolor/Location）進行同源性比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 的純度檢測

將提取后的各供試材料基因組DNA 用紫外分光光度計在不同吸光度（OD）下檢測結(jié)果顯示，OD260/OD280均在1.80～2.00 范圍內(nèi)，說明所提取的DNA 濃度適宜。進而用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，各樣品電泳條帶清晰穩(wěn)定，無拖尾降解現(xiàn)象（圖1），表明DNA 純度高，完全能滿足SSR 分子標記試驗的要求。

圖1 高丹草F2部分單株基因組DNA 電泳檢測Fig.1 Sorghum-sudangrass hybrids of F2 plants genomic DNA electrophoresis results

2.2 高丹草F2 BSA 混池及其親本DNA 擴增

用70 對SSR 引物對F2的高氰和低氰植株基因池及親本DNA 進行PCR 擴增及電泳檢測結(jié)果表明，70 對引物中有9 對引物（表1）可以區(qū)分高氰、低氰性狀（在高氰中無SSR 條帶，在低氰中有明顯的SSR 條帶）。9 對引物中，篩選到與高丹草低氰性狀有關(guān)的特異性SSR 條帶共26 個，其片段大小在100～750 bp（表2，圖2）。從圖2 還可以看出，個別條帶帶型較寬，例如TF3-240、TF8-100 等，這可能是相似的序列遷移造成的，需要進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后進一步純化。

圖2 高丹草BSA 混池及親本部分SSR 低氰目的片段的篩選Fig.2 Screening of low cyanide target fragments of the BSA gene pools of sorghum-sudangrass hybrid and parents

表1 9 對SSR 適宜引物的堿基序列Table 1 The nucleotide sequences of 9 pairs of SSR primers combinations

表2 高丹草SSR 低氰目的片段篩選Table 2 Screening results of low cyanide target fragments in sorghum-sudangrass hybrid

2.3 二次PCR 擴增檢測與純化

將26 個低氰SSR 目的片段切膠回收后作為模板，按原PCR 程序再次擴增，擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳 檢 測 發(fā) 現(xiàn) ，共 有 14 個 低 氰 DNA 片 段 目 的 片 段（TF2、TF4～TF6、TF8、TF11、TF12、TF14、TF15、TF17～TF20 和TF26）均呈現(xiàn)出一條清晰的DNA 條帶（圖3），表明這14 個片段不需要純化；而有12 個低氰片段（TF1、TF3、TF7、TF9、TF10、TF13、TF16、TF21～TF25）出現(xiàn)了 2 條以上條帶，說明這 12 個目的片段回收質(zhì)量較差，需從SDS?PAGE 中進行純化。

圖3 26 個低氰目的片段二次擴增檢測Fig.3 Secondary amplification detection of 26 low cyanide target fragments

經(jīng)純化后的12 個低氰DNA 目的片段均呈現(xiàn)單一清晰的條帶，其分子量大小在250 bp 左右，與前面聚丙烯酰胺凝膠中的條帶相吻合（150～300 bp），表明DNA 片段純度高，純化效果理想，符合測序要求（圖4）。

圖4 12 個低氰目的片段純化檢測Fig.4 Purification and detection of 12 low cyanide target fragments

2.4 目的片段測序分析

從表3、圖5 和圖6 可知，26 個低氰目的片段測序長度在56～672 bp 范圍內(nèi)，這與Marker 估計片段大小100～750 bp 有一定差異，如原片段 TF1、TF2、TF8 和 TF16 的大小分別為 300、280、100 和 550 bp，而實際測序結(jié)果分別為282、271、101 和586 bp，表明目的片段對應(yīng)的Marker 遷移的位置與堿基序列的大小存在一定差異。

圖6 高丹草部分低氰目的片段DNA 堿基序列Fig.6 DNA base sequence of some low cyanide target fragments in sorghum-sudangrass hybrid

表3 26 個低氰目的片段DNA 測序Table 3 DNA sequencing results of 26 low cyanide target fragments

低氰片段TF1、TF2、TF8 和TF16 的序列峰圖中，用綠色、紅色、黑色和藍色4 種顏色的峰表示4 種堿基（A、T、G、C）的信號強度；圖中波峰與波谷清晰，峰與峰之間的距離均勻；未出現(xiàn)重疊峰與堿基缺失，在底部沒有雜峰干擾，表明測序結(jié)果是理想的（圖5）。

2.5 同源性分析

根據(jù)DNA 測序結(jié)果，利用BLAST（http//：www.ncbi.nLm.nih.gov/BLAST/）網(wǎng)站序列數(shù)據(jù)庫和高粱基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.gramene.org/Sorghum_bicolor/Location）對篩選出的26 個低氰目的片段進行同源性比對發(fā)現(xiàn)，14 個序列具有同源性，目的片段 TF1、TF4、TF5、TF12 和 TF26 與過氧化物酶受體 XM_002758639.5、K0J259、AF310249.1、A0A2K6B7D4 和 A0A2K6RRD2 的同源性在 88.2%～100.0% 范圍內(nèi)；片段 TF17 與干腐菌未表征蛋白F8QJV4 的同源性為96.4%，TF18 與未培養(yǎng)的真菌克隆基因MT703519.1 的同源性為91.6%；片段TF21 與鼠傷寒沙門氏菌氨肽酶Q8ZQ76 的同源性為84.6%；片段TF19 和TF20 與黃孢原毛單胞菌18S RNA基因的同源性為83.2%；片段TF23 與磷脂酰絲氨酸脫羧酶原酶2 基因A0A072PQP8 的同源性為81.3%；片段TF25 與甘藍型油菜蛋白A0A078FW90 的同源性為81.0%；而與高粱基因組序列相關(guān)的只有TF8 和TF16 2 個片段，其中TF8 與葉綠體磷酸核糖激酶XM_021458168.1 的同源性高達95.4%，片段TF16 與高粱克隆BAC 88M4 基因AY661656.1 的同源性高達到97.0%，這表明這2 個基因與高丹草的低氰性狀相關(guān)，推測其是調(diào)控低氫氰酸含量性狀的基因。其余的 TF2、TF3、TF6、TF7、TF9～TF11、TF13～TF15、TF22 和 TF24 這 12 個片段的堿基序列沒有同源性（表4），說明前人尚未研究與這些DNA 目的片段相關(guān)的基因。

表4 高丹草低氰目的片段同源性比對Table 4 Identity of comparison of low cyanide target fragments in sorghum-sudangrass hybrid

2.6 低氰目的片段TF8 和TF16 的堿基序列比對

用DNAMAN 8.0 軟件，將低氰父本紅殼蘇丹草及低氰F2共有目的片段TF8 和TF16 與同源性高的高粱基因AY661656.1 和XM_021458168.1 進行了序列比對和反向翻譯，發(fā)現(xiàn)低氰父本紅殼蘇丹草及F2的低氰片段堿基序列完全一致，而與高粱基因的堿基比對有一定的變異。進而將低氰序列代入BLASTn，得到片段TF8 的登錄號為lcl|Query_51852，片段TF16 的登錄號為lcl|Query_10405。前者與高粱葉綠體磷酸核糖激酶XM_021458168.1 基因相比，發(fā)生了3 次堿基替換（C-A、A-T 和C-G）和1 個C 堿基插入，相應(yīng)的丙氨酸和甘氨酸替換成半胱氨酸，蘇氨酸替換成丙氨酸，而缺失了甘氨酸；后者與高粱克隆BAC 88M4 基因AY661656.1 相比，僅有一個A 堿基缺失，導(dǎo)致丙氨酸缺失（圖7 和表5）。

表5 低氰片段TF8 和TF16 氨基酸差異Table 5 The difference amino acids of low cyanide fragments TF8 and TF16

圖 5 低氰目的片段 TF1、TF2、TF8、TF16 的序列峰Fig.5 Sequence peaks of some low hydrocyanic acid target fragments TF1，TF2，TF8，TF16

圖7 低氰目的片段TF8 和TF16 堿基序列特征Fig.7 Base sequence characteristics of TF8 and TF16 of low cyanide target fragments

綜上，本研究首次找到了兩個（XM_021458168.1 和AY661656.1）與高粱相關(guān)的低氰性狀片段基因，但這兩個基因的功能注釋中并沒有關(guān)于氫氰酸性狀的描述，本試驗補充了這兩個基因具有調(diào)控低氰性狀的作用，從而為下一步高丹草低氰性狀主效QTL 精細定位、圖位克隆及標記輔助等研究奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

本試驗將獲得的26 個低氰SSR?PCR 產(chǎn)物片段進行回收、純化、測序后，與BLASTn 比對發(fā)現(xiàn)，其在GenBank 數(shù)據(jù)庫中有14 個目的片段與過氧化物酶、真菌、氨肽酶、葉綠體磷酸核糖激酶和BAC 88M4 基因的同源性在81.0%～100.0%范圍內(nèi)，其中葉綠體磷酸核糖激酶和BAC 88M4 分別是高粱基因XM_021458168.1 和AY661656.1 的功能注釋，它們正好與低氰片段TF8 和TF16 相對應(yīng)，其同源性分別高達95.4%和97.0%。進一步通過比對分析堿基序列發(fā)現(xiàn)，片段TF8 在XM_021458168.1 基因的218～276 bp 之間的丙氨酸和甘氨酸替換為半胱氨酸，蘇氨酸替換為丙氨酸，甘氨酸缺失；片段TF16 在AY661656.1 基因的127691～127632 bp 之間僅有1個丙氨酸缺失。據(jù)此推測TF8 和TF16 這2 個低氰DNA 片段由于半胱氨酸、丙氨酸和甘氨酸發(fā)生替換和缺失，產(chǎn)生了調(diào)控低氫氰酸含量性狀的功能。研究表明，XM_021458168.1 編碼高粱葉綠體磷酸核糖激酶，而磷酸核糖激酶（phosphoribulokinase，PRK）是（calvin-benson-bassham）CBB 循環(huán)的必需酶［25?28］，表明 XM_021458168.1 可能調(diào)控氫氰酸的合成，其調(diào)控機制有待深入研究。其余12 個DNA 目的片段在現(xiàn)有GenBank 數(shù)據(jù)庫中尚未找到同源性數(shù)據(jù)，這與劉改艷等［29］在研究烏鱧性別時發(fā)現(xiàn)8 個可以區(qū)分烏鱧性別的DNA 目的片段，卻在GenBank 中沒有找到相似的同源性數(shù)據(jù)，表明現(xiàn)有的GenBank 數(shù)據(jù)庫還需要研究者們不斷完善。

BSA 法在植物重要性狀目的基因片段篩選中，已有一些成功應(yīng)用的研究報道［30］。本試驗采用BSA 與SSR結(jié)合的方法篩選出26 個與低氰相關(guān)的DNA 目的片段，從中首次鑒定出TF8 和TF16 這2 個DNA 目的片段基因具有調(diào)控低氫氰酸含量性狀的作用，再次證明BSA 法是篩選和鑒定植物目標性狀基因片段的一種有效方法，它不僅可以克服沒有創(chuàng)建近等基因系的限制［31］，而且還具有省時和減少工作量的優(yōu)點。

本試驗在對高丹草低氰SSR 目的片段切膠回收過程中發(fā)現(xiàn)，按原引物及PCR 體系、程序進行二次PCR 擴增及產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測時，出現(xiàn)了目的片段條帶2 條以上的現(xiàn)象（圖3），且主要出現(xiàn)在原目的條帶相鄰位置。通過與原樣品聚丙烯酰胺凝膠的條帶逐一對比發(fā)現(xiàn)，并未產(chǎn)生的新的SSR 條帶，表明在瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)了DNA 條帶共遷移現(xiàn)象［32?33］。為了消除DNA 測序帶來的誤差，對出現(xiàn)共遷移現(xiàn)象的低氰DNA 片段條帶進行了純化，保證了DNA 片段測序的準確性（圖4）。該經(jīng)驗可為今后類似試驗研究提供借鑒。

4 結(jié)論

利用BSA?SSR 技術(shù)篩選出26 個高丹草低氰SSR 目的片段，經(jīng)測序分析明確了這26 個低氰DNA 片段的堿基序列。序列比對發(fā)現(xiàn)，TF8 和TF16 這2 個低氰目的片段分別與高粱葉綠體磷酸核糖激酶XM_021458168.1 和高粱克隆BAC 88M4 AY661656.1 基因同源性高達95.4%和97.0%，片段大小分別為101 和586 bp。但在DNA堿基上有一定變異，TF8 片段發(fā)生了3 次堿基替換和1 次插入（C-A、A-T、C-G、C 堿基插入），導(dǎo)致丙氨酸和甘氨酸替換成半胱氨酸，蘇氨酸替換成丙氨酸，甘氨酸缺失；TF16 片段有1 個A 堿基缺失，導(dǎo)致丙氨酸缺失。據(jù)此推斷TF8 和TF16 低氰片段有調(diào)控低氫氰酸含量性狀的功能。