新型修飾β-淀粉酶酶解淀粉制備高麥芽糖漿工藝

李軍瑞,鄺宇,黃田,馬忠明,梁新紅

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

麥芽糖漿是以優(yōu)質(zhì)淀粉為原料,經(jīng)過(guò)液化、糖化、脫色過(guò)濾、精制、濃縮而成的一種淀粉糖產(chǎn)品,其主要成分是麥芽糖[1-2].麥芽糖不參與胰島素代謝,具有較低的吸潮性和較高的保濕型,并且抗結(jié)晶性良好,能抑制食品脫水和淀粉老化,延長(zhǎng)食品的貯藏期;另外,麥芽糖漿具有甜度適中和營(yíng)養(yǎng)性高的特點(diǎn),能較好代替熱能食品[3-4],因此,麥芽糖漿被廣泛應(yīng)用在食品和醫(yī)藥行業(yè).

目前,酶法工藝是國(guó)內(nèi)外麥芽糖漿主要采用的生產(chǎn)方式[5-6],酶法制備麥芽糖漿主要有液化酶和糖化酶,其中常見(jiàn)液化酶為α-淀粉酶[7-9],而β-淀粉酶為麥芽糖生產(chǎn)中最重要的糖化酶.目前,工業(yè)用β-淀粉酶(1,4-α-D-glucan maltohydrolase,E.C.3.2.1.2)大多都來(lái)源于甘薯、大麥等高等植物,甘薯β-淀粉酶和大麥β-淀粉酶在食品行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[10].β-淀粉酶作為外切酶作用于淀粉,產(chǎn)物主要是麥芽糖和β-界限糊精,在食品工業(yè)中,玉米、甘薯、馬鈴薯和木薯淀粉等是很好生產(chǎn)麥芽糖的原料[11].甘薯β-淀粉酶轉(zhuǎn)化淀粉時(shí),產(chǎn)物中的麥芽糖含量多,副產(chǎn)物少,在生產(chǎn)高純度麥芽糖或結(jié)晶麥芽糖方面具有很大優(yōu)勢(shì)[12].

作為一種活性蛋白,β-淀粉酶的催化效率極易受到生產(chǎn)環(huán)境的影響[13],導(dǎo)致麥芽糖含量下降,并且不利于高麥芽糖漿的生產(chǎn).目前酶分子化學(xué)修飾是提高酶的穩(wěn)定性、生物活性或者延長(zhǎng)酶的半衰期的一種非常有效的手段,Tardioli等[14]將糖化酶中的羧基與乙二胺中的氨基經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾進(jìn)行胺化,胺化后的酶保留了良好的活性,而且胺化之后的酶性質(zhì)非常穩(wěn)定,其穩(wěn)定性比水溶性酶提高500倍以上.Xue等[15]利用酸酐基團(tuán)對(duì)菠蘿蛋白酶進(jìn)行修飾,增強(qiáng)了菠蘿蛋白酶的熱穩(wěn)定性和耐堿性.酶修飾技術(shù)在β-淀粉酶的研究上也有進(jìn)一步的應(yīng)用,Daba等[16]用三硝基苯磺酸(TNBS)、mPEG、戊二醛(GA)對(duì)小麥β-淀粉酶進(jìn)行修飾,結(jié)果表明,經(jīng)mPEG修飾后夠明顯提高酶的活力和熱穩(wěn)定性,但GA只能提高酶的熱穩(wěn)定性;TNBS可以提高酶的活力,但酶穩(wěn)定性明顯降低.本課題組已經(jīng)研究了甘薯β-淀粉酶經(jīng)甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺(Methoxy polyethylene glycol maleic amide,MPEG-Mal,MW:5000)修飾可以提高酶的催化效率和改善酶的特性,與未修飾甘薯β-淀粉酶比較,獲得的新型修飾甘薯β-淀粉酶酶活性由1.733×104U/mg提高至2.150×104U/mg,提高了(24.06±3.17)%,其熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性也明顯提高[17],但還未應(yīng)用到高麥芽糖漿的生產(chǎn)中.因此將新型修飾β-淀粉酶應(yīng)用于高麥芽糖漿的生產(chǎn),以期為新型修飾酶工業(yè)化應(yīng)用提供理論支持.

本文采用高效液相色譜對(duì)新型修飾β-淀粉酶酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,研究添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度及酶解pH對(duì)甘薯淀粉制備高麥芽糖漿時(shí)麥芽糖產(chǎn)量的影響,并應(yīng)用新型修飾β-淀粉酶對(duì)甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉和馬鈴薯淀粉進(jìn)行酶解試驗(yàn).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1原料與試劑 甘薯,河南科技學(xué)院甘薯試驗(yàn)田;甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉和馬鈴薯淀粉,新鄉(xiāng)市華聯(lián)超市;耐高溫α-淀粉酶,鄭州市福源生物科技有限公司;甲氧基聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺,Sigma-Aldrich公司;葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖,Sigma-Aldrich公司;乙腈,Sigma-Aldrich公司.

1.1.2主要儀器設(shè)備Waters 1525-2414高效液相色譜儀,高效液相色譜系統(tǒng)由Waters 1525 Binary HPLC Pump,Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器,Waters 2414示差檢測(cè)器等組成,美國(guó)Water公司;Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱,日本Shodex公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 β-淀粉酶酶活測(cè)定方法β-淀粉酶酶活測(cè)定參考文獻(xiàn)[17].

1.2.2 甘薯β-淀粉酶分離純化 粗酶液的制備:參考文獻(xiàn)[18]的方法制備;β-淀粉酶分離純化:應(yīng)用AKTA purifierTM10蛋白質(zhì)純化儀,Mono Q陰離子交換層析柱和SuperdexTM75凝膠層析柱,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm條件下進(jìn)行分離純化,具體方法及步驟參考文獻(xiàn)[19].將出峰位置所對(duì)應(yīng)的收集管中的酶液分別收集,濃縮后冷凍干燥,4℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 新型β-淀粉酶制備 新型修飾β-淀粉酶儲(chǔ)備液制備參考文獻(xiàn)[17]:準(zhǔn)確稱量50 mg新型修飾β-淀粉酶溶到2.5 mL pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中4℃儲(chǔ)藏備用;新型修飾β-淀粉酶的制備:參考Liang等參考文獻(xiàn)[17]的方法.

1.2.4 高麥芽糖漿制備 以淀粉為原料,新型修飾β-淀粉酶酶解淀粉的工藝流程[1]為

按照淀粉與水的比例為1∶3.5～4.0調(diào)漿,調(diào)整淀粉漿溫度90～95℃,加入α-淀粉酶,酶添加量為5 U/g,淀粉漿迅速液化,將淀粉漿降溫至60℃,加入一定量的新型修飾β-淀粉酶,按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)保溫一定時(shí)間,結(jié)束糖化,即可獲得高麥芽糖漿.

1.2.5 新型修飾β-淀粉酶酶解溫度對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響 參考梁新紅等[20]的方法,并稍作修改.加入高溫α-淀粉酶5 U/g,加入新型修飾β-淀粉酶120 U/g干淀粉,時(shí)間16 h,pH為6.0,研究新型修飾β-淀粉酶酶解溫度在35、40、45、50、55、60、65和70℃下對(duì)麥芽糖含量的影響.

1.2.6 新型修飾β-淀粉酶酶解pH對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響 參考Liang等[17]的方法,并稍作修改.加入高溫α-淀粉酶5 U/g,酶解溫度為55℃,加入新型修飾β-淀粉酶120 U/g干淀粉,酶解16 h,研究酶解pH在4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0下麥芽糖含量的影響.

1.2.7 新型修飾β-淀粉酶添加量對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.3,加入5 U/g高溫α-淀粉酶,溫度55℃,酶解16 h,酶解pH 6.0,研究新型修飾β-淀粉酶添加量為0、30、60、90、120、150、180、210 U/g干淀粉時(shí)對(duì)麥芽糖含量的影響.

1.2.8 新型修飾β-淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.4,加入高溫α-淀粉酶5 U/g,酶解溫度55℃,加入新型修飾β-淀粉酶120 U/g干淀粉,pH 6.0,研究新型修飾β-淀粉酶酶解時(shí)間為0、4、8、12、16、20、24 h時(shí)對(duì)麥芽糖含量的影響.

1.2.9 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn),對(duì)新型修飾β-淀粉酶酶解條件進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)計(jì)酶解溫度、酶解pH、酶添加量及酶解時(shí)間對(duì)酶解甘薯淀粉的麥芽糖含量影響的正交試驗(yàn)優(yōu)化.

1.3 分析方法

HPLC法測(cè)定酶解產(chǎn)物中糖含量[21]:分別稱取0.1 g的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖,用流動(dòng)相(70%的乙腈)定容,得到4種糖質(zhì)量濃度均為5.0 mg/mL的混合糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,在4℃下保存.使用流動(dòng)相將100μL高麥芽糖漿進(jìn)行稀釋,柱溫箱內(nèi)外部溫度分別為35℃、30℃.流動(dòng)相為70%乙腈,經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾,超聲脫氣15 min,流速為1 mL/min,進(jìn)樣體積為20μL,用外標(biāo)法定量檢測(cè)4種標(biāo)準(zhǔn)溶液的糖含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 新型修飾β-淀粉酶酶解可溶性淀粉產(chǎn)物的HPLC分析

依據(jù)方法1.3,在色譜分析條件下,采用HPLC對(duì)糖標(biāo)準(zhǔn)樣品和新型修飾β-淀粉酶酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1和圖2所示.

圖1 糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC圖譜Fig.1 HPLCspectrum of standard saccharides

圖2 新型修飾β-淀粉酶酶解可溶性淀粉產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of soluble starch hydrolysates by novel modifiedβ-amylase

由圖2可知,新型修飾β-淀粉酶酶解可溶性淀粉酶解產(chǎn)物色譜圖中出現(xiàn)4個(gè)吸收峰,與圖1標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖對(duì)比分析,得到新型修飾β-淀粉酶酶解淀粉產(chǎn)物的峰保留時(shí)間與糖標(biāo)準(zhǔn)品峰保留時(shí)間基本一致.采用HPLC外標(biāo)法計(jì)算酶解產(chǎn)物中糖的含量,結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 新型修飾β-淀粉酶酶解可溶性淀粉產(chǎn)物分析Tab.2 Analysis of hydrolysates of soluble starch by novel modifiedβ-amylase %

由表1可知,新型修飾β-淀粉酶酶解可溶性淀粉產(chǎn)物中低聚糖主要為麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、葡萄糖及其他聚合度糊精,其中麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)(83.51±4.38)%,聚合度5以上的糊精僅為(4.53±0.17)%.研究結(jié)果與陳松玲等[21]對(duì)β-淀粉酶酶解甘薯淀粉、小麥淀粉、玉米淀粉和馬鈴薯淀粉等酶解產(chǎn)物中糖量測(cè)定結(jié)果相近.

2.2 新型修飾β-淀粉酶酶解淀粉制備高麥芽糖漿單因素試驗(yàn)研究

2.2.1 新型修飾β-淀粉酶酶解溫度對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.5,研究新型修飾β-淀粉酶酶解溫度對(duì)甘薯淀粉酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量的影響,結(jié)果如圖3所示.

圖3 新型修飾β-淀粉酶酶解溫度對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis temperature of novel modifiedβ-amylase on maltose yield

由圖3可知,隨著新型修飾β-淀粉酶酶解溫度的升高,麥芽糖含量不斷增加,當(dāng)新型修飾β-淀粉酶酶解溫度在55℃時(shí),麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值(86.92±2.93)%;當(dāng)新型修飾β-淀粉酶酶解溫度繼續(xù)升高時(shí),麥芽糖含量顯著降低,酶解溫度達(dá)70℃時(shí),麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為(42.56±1.68)%.因此,新型修飾β-淀粉酶的最佳溫度為55℃.

2.2.2 新型修飾β-淀粉酶酶解pH對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.6,研究新型修飾β-淀粉酶酶解pH對(duì)甘薯淀粉酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量的影響,結(jié)果如圖4所示.

圖4 新型修飾β-淀粉酶酶解pH對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis pH of novel modifiedβ-amylase on maltose yield

由圖4可知,隨著新型修飾β-淀粉酶酶解pH的升高,麥芽糖含量逐漸增加,當(dāng)新型修飾β-淀粉酶酶解pH在6.0時(shí),麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值(88.36±3.15)%;隨著新型修飾β-淀粉酶酶解pH繼續(xù)升高,麥芽糖含量逐漸降低,當(dāng)酶解pH升至8.0時(shí),麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為(27.62±1.14)%.因此,新型修飾β-淀粉酶的最佳pH為6.0.

2.2.3 新型修飾β-淀粉酶添加量對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.7,研究新型修飾β-淀粉酶添加量對(duì)甘薯淀粉酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量的影響,結(jié)果如圖5所示.

圖5 新型修飾β-淀粉酶添加量對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響Fig.5 Effects of amylase addition of novel modifiedβ-amylase on maltose yield

由圖5可知,新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉,添加量在0～120 U/g時(shí),隨著新型修飾β-淀粉酶添加量的增加,酶解產(chǎn)物中麥芽糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從(14.33±0.85)%增加到(85.73±3.03)%,新型修飾β-淀粉酶添加量大于120 U/g時(shí),酶解產(chǎn)物麥芽糖含量沒(méi)有顯著性差異(P＜0.05).因此,新型修飾β-淀粉酶的最佳加酶量為120 U/g.

2.2.4 新型修飾β-淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響 依據(jù)方法1.2.8,考察新型修飾β-淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)甘薯淀粉酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量的影響,結(jié)果如圖6.

圖6 新型修飾β-淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)麥芽糖產(chǎn)率的影響Fig.6 Effects of enzymatic hydrolysis time of novel modifiedβ-amylase on maltose yield

由圖6可知,新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉,酶解時(shí)間在0～16 h時(shí),麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從(14.33±0.85)%增至(86.17±2.56)%,繼續(xù)增加新型修飾β-淀粉酶酶解時(shí)間,麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒(méi)有明顯變化.根據(jù)方差顯著性分析,新型修飾β-淀粉酶酶解時(shí)間在16～28 h時(shí)麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒(méi)有顯著性差異(P＜0.05).因此,新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉的最佳時(shí)間為16 h.

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn),采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察新型修飾β-淀粉酶酶解溫度、酶解pH、酶添加量及酶解時(shí)間四種因素對(duì)甘薯淀粉水解效果的影響,以麥芽糖含量為指標(biāo),新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2.

表2 新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉因素水平表Tab.1 The level table of starch factors in enzymatic hydrolysis of sweet potato by novel modifiedβ-amylase

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表3.

表3 新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.3 Analysis of orthogonal experiment results of enzymatic hydrolysis of sweet potato starch with novel modifiedβ-amylase

由表3分析可知,影響麥芽糖含量因素的主次順序?yàn)?B＞A＞C＞D,即新型修飾β-淀粉酶的酶解pH＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解時(shí)間.根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果,酶解pH對(duì)麥芽糖含量的影響最大,酶解時(shí)間對(duì)麥芽糖含量的影響最小.因素最佳組合為A2B2C3D2,即新型修飾β-淀粉酶酶解pH為6.0,酶解溫度為55℃,加酶量為150 U/g,酶解時(shí)間為16 h.對(duì)新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步方差分析,結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment results of enzymatic hydrolysis of sweet potato starch by novel modifiedβ-amylase

由表4可知,新型修飾β-淀粉酶酶解溫度、酶解pH及酶添加量對(duì)麥芽糖含量有顯著性差異,表明這三個(gè)因素對(duì)麥芽糖含量影響較大.

綜上所述,新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉最佳參數(shù):酶解pH為6.0,酶解溫度為55℃,加酶量為150 U/g,酶解時(shí)間為16 h.

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照上述試驗(yàn)得到的最佳參數(shù),平行進(jìn)行三次試驗(yàn),測(cè)得麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(89.02±3.23)%,(89.11±3.34)%,(88.98±3.29)%,3次測(cè)得的平均值為(89.04±3.29)%.表明該參數(shù)可行.

2.5 新型修飾β-淀粉酶和甘薯β-淀粉酶酶解酶解淀粉效果比較

為對(duì)比新型修飾酶的酶解效果,分別應(yīng)用新型修飾β-淀粉酶和未修飾的甘薯β-淀粉酶酶解甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉制備高麥芽糖漿.酶解條件為:高溫α-淀粉酶添加量5 U/g,酶解溫度55℃,酶解pH 6.0,新型修飾β-淀粉酶和甘薯β-淀粉酶添加量均為150 U/g,酶解時(shí)間均為16 h.酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 新型修飾β-淀粉酶和甘薯β-淀粉酶酶解淀粉產(chǎn)生麥芽糖含量比較Tab.5 Comparison of maltose content produced by enzymatic hydrolysis of starch by novel modifiedβ-amylase and sweet potato β-amylase

由表5可知,應(yīng)用新型修飾β-淀粉酶和未修飾甘薯β-淀粉酶在相同條件下分別酶解甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉和馬鈴薯淀粉,新型修飾β-淀粉酶的酶解效率均顯著高于未修飾甘薯β-淀粉酶(P＜0.05).梁新紅等[20]研究了甘薯β-淀粉酶酶解甘薯淀粉條件,即加酶量200 U/g,酶解時(shí)間28 h時(shí),酶解產(chǎn)物中麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(73.29±5.22)%,本研究中將新型修飾β-淀粉酶應(yīng)用于甘薯淀粉酶解,酶添加量減少了50 U/g,酶解時(shí)間縮短了12 h,但麥芽糖含量提升了17.69%;同時(shí),梁新紅等[20]在應(yīng)用甘薯β-淀粉酶和新型修飾β-淀粉酶酶解玉米淀粉時(shí)也獲得了類似的結(jié)果.因此,應(yīng)用新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉,不僅減少了酶的用量,提高了酶解效率,而且提高了酶解產(chǎn)物中麥芽糖含量.

同時(shí),由表5也可以看出,新型修飾β-淀粉酶對(duì)甘薯淀粉和小麥淀粉的酶解效率高于玉米淀粉和馬鈴薯淀粉,這可能與不同植物淀粉的聚合度和結(jié)晶度不同有關(guān),其機(jī)理有待于進(jìn)一步探究.

3 結(jié)論

新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉時(shí),酶解產(chǎn)物中的糖主要為麥芽糖,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)80%以上.通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)可知,新型修飾β-淀粉酶酶解淀粉最優(yōu)參數(shù)為:酶解pH 6.0,酶解溫度55℃,酶添加量150 U/g,酶解時(shí)間16 h.在最佳酶解條件下,新型修飾β-淀粉酶酶解甘薯淀粉的麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(89.04±3.29)%,與未修飾酶相比,麥芽糖含量提高了31.21%.應(yīng)用新型修飾酶生產(chǎn)高麥芽糖漿,減少了酶的用量,降低了生產(chǎn)成本,提高了酶解效率,為工業(yè)化提高麥芽糖漿生產(chǎn)效率及降低成本提供理論及實(shí)踐依據(jù).