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      海洋細(xì)菌BMF04菌株的抑菌和毒素去除作用

      2021-07-17 05:19:44李文進(jìn)湯曼利周榮翔李霽虹王雨婷馬桂珍暴增海
      食品工業(yè)科技 2021年14期
      關(guān)鍵詞:赤霉病發(fā)酵液毒素

      彭 云,李文進(jìn),湯曼利,周榮翔,李霽虹,董 霆,王雨婷,馬桂珍,暴增海

      (江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇連云港 222005)

      小麥赤霉?。‵usariumHead Blight,FHB)是由小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)和小麥雪腐鐮刀菌(Fusarium nivale(Fr)Ces.)等多種鐮刀菌引起的真菌病害[1],感病后導(dǎo)致籽粒皺縮,品質(zhì)下降,產(chǎn)生可破壞人和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)、致癌、致畸的等多種毒素,嚴(yán)重威脅到人畜的健康安全[2?4]。ZEN 毒素是世界上污染最為廣泛的鐮刀菌毒素,在全世界谷物以及農(nóng)副產(chǎn)品中檢出率高90%[5],我國(guó)糧食原料及飼料中霉菌毒素污染十分普遍且嚴(yán)重[6?8],不同地區(qū)和不同季節(jié)的原料及飼料產(chǎn)品檢出率為70%~100%[9]。開(kāi)發(fā)安全有效的方法控制毒素的產(chǎn)生和去除已產(chǎn)生的毒素迫在眉睫。

      傳統(tǒng)的毒素降解方法主要有物理降解法和化學(xué)降解法。工業(yè)上主要采取活性炭、硅鋁酸鹽、寡聚糖等物理吸附劑吸附,其有較強(qiáng)選擇性,能有效降低生產(chǎn)成本,但是物理吸附劑易破壞營(yíng)養(yǎng)成分而影響營(yíng)養(yǎng)素的吸收。Volko 等[10]研究表明,毒素吸附劑不能有效徹底去除ZEN 毒素,對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能產(chǎn)生很大影響。化學(xué)脫毒法通過(guò)氧化處理或堿處理,可達(dá)到比物理脫毒方法更好的效果,但化學(xué)脫毒方法難以在實(shí)際生產(chǎn)中大規(guī)模進(jìn)行,添加化學(xué)試劑可能在糧食和飼料中有殘留,造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)破壞和二次污染等,存在著不可避免的局限性[11]。生物降解法主要由微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物和胞內(nèi)、胞外酶分解毒素,產(chǎn)生的降解產(chǎn)物無(wú)毒,并對(duì)原料中的其他成分沒(méi)有破壞作用,不會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,是解決霉菌毒素污染的發(fā)展方向和趨勢(shì)。目前用于毒素降解的微生物菌株較少,篩選既能夠高效抑制小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌生長(zhǎng)又能去除毒素的微生物生防菌株,可以有效減少小麥赤霉病的發(fā)生和毒素的產(chǎn)生,對(duì)于保障食品安全有重要意義[12?14]。國(guó)內(nèi)外不同學(xué)者已經(jīng)從土壤等不同環(huán)境中分離到一些降解ZEN 毒素的微生物菌株,主要有紅球菌(Rhodococcus)[15?16]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[17?18]、鏈霉菌(Streptomyces)[19]、假單胞菌(Pseudomonas)[20]、酵母菌等[21?22],應(yīng)用微生物去除毒素已經(jīng)成為發(fā)展趨勢(shì)。

      BMF04 菌株是本實(shí)驗(yàn)室從連云港海域分離的對(duì)多種病原菌具有較強(qiáng)抑制作用,并具有促生作用的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)[23],有關(guān)該菌株對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀病菌的抑制作用及其對(duì)ZEN 毒素的去除作用尚未進(jìn)行研究,本研究測(cè)定該菌株對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀病菌菌絲的抑菌作用和對(duì)ZEN 毒素的降解作用,探究其降解ZEN 毒素的降解機(jī)理,為該菌株用于降解ZEN 毒素提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      供試菌株:海洋甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BMF04(B.methylotrophicus) 由本實(shí)驗(yàn)室從連云港海域分離并保存;小麥赤霉病菌(F.graminearum)、小麥雪腐鐮刀菌(F.nivale(Fr)Ces.)、大腸桿菌(Escherichia coli)、解淀粉芽孢桿菌GM-1-2(Bacillus amyloliquefaciens) 由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存;PDA 培養(yǎng)基、PD 培養(yǎng)基、DF 培養(yǎng)基(2.44 g/L Na2HPO4,1.52 g/L KH2PO4,0.5 g/L(NH4)2SO4,0.2 g/L MgSO4·7H2O,0.05 g/L CaCl2) 實(shí)驗(yàn)室自配;玉米赤霉烯酮毒素(ZEN) 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所制備提供;胰蛋白酶(25 萬(wàn) U/g) Biosharp 公司;胃蛋白酶(300 萬(wàn)~350 萬(wàn) U/g) Bio Basic Inc 公司;蛋白酶K(4 萬(wàn) U/g) 德國(guó)MERCK 公司。

      安捷倫1260 高效液相色譜儀(配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、OpenLAB 3.3.2 SP3 安捷倫液相色譜化學(xué)工作站) 美國(guó)安捷倫公司;Biosafer-20TC 實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器 賽飛(中國(guó))有限公司;MIKIO 200 R 高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich 科學(xué)儀器有限公司;JY92-IIDN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)隔音箱 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 BMF04 菌株及無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

      1.2.1.1 菌株對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 采用平板對(duì)峙法測(cè)定BMF04菌株對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲的抑制作用。小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌在PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)3 d,用打孔器取直徑1 cm 的菌苔分別接種于新的PDA 平板中央,在距離培養(yǎng)皿邊緣2 cm 處劃線接種BMF04 菌株,接種3 次為3 重復(fù),以不接菌為對(duì)照,28 ℃培養(yǎng)3 d,測(cè)定抑菌帶寬度。

      抑菌帶寬度(mm)=對(duì)照病原菌菌落半徑(mm)?處理病原菌菌落半徑(mm)[24]

      1.2.1.2 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 將BMF04 菌株接種到裝有60 mL PD 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中,28 ℃,180 r/min 振蕩培養(yǎng)52 h。發(fā)酵液于4 ℃、8000 r/min離心15 min,將上清液用0.22 μm 的微孔過(guò)濾器過(guò)濾得到無(wú)菌發(fā)酵液。采用打孔法測(cè)定無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲的抑制作用。在PDA 平板中央接種直徑5 mm 的培養(yǎng)了3 d 的小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌苔,在距病原菌15 mm 處等距離用直徑8 mm 的打孔器打孔,每孔分別加入150 μL 不同菌株的無(wú)菌發(fā)酵液,以等量PD 培養(yǎng)基為對(duì)照,28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d,測(cè)量BMF04菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌的抑菌圈直徑,每個(gè)病原菌株3 次重復(fù)[24]。

      1.2.2 BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素去除作用的研究

      1.2.2.1 定性測(cè)定 挑取BMF04 菌株接種在濃度為4 μg/mL 含ZEN 毒素平板上,28 ℃培養(yǎng)3 d,觀察BMF04 菌株的生長(zhǎng)情況,若BMF04 菌株能生長(zhǎng),說(shuō)明該菌株具有去除ZEN 毒素作用。以不具有毒素去除作用的大腸桿菌(E.coli)為陰性對(duì)照,以具有解毒作用的B.amyloliquefaciens的GM-1-2 菌株為陽(yáng)性對(duì)照[25]。

      1.2.2.2 定量測(cè)定 ZEN 毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:分別配制2、4、6、8、10、12、14、16 μg/mL ZEN 毒素溶液,采用HPLC 法測(cè)定不同濃度毒素溶液的色譜峰面積,每個(gè)濃度測(cè)定3 次取平均值。HPLC 檢測(cè)ZEN 毒素的條件:色譜儀為安捷倫高效液相色譜儀;色譜柱為安捷倫反相C18柱,孔徑4 μm,長(zhǎng)250 mm×寬4.6 mm;流動(dòng)相為甲醇:水=80:20(V/V);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為236 nm;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量20 μL;流速1 mL/min。以ZEN 濃度為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制ZEN 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素的去除作用測(cè)定:挑取BMF04 菌株接種于PDA 培養(yǎng)基斜面,28 ℃培養(yǎng)18 h,用無(wú)菌DF 培養(yǎng)基洗下菌體,并調(diào)節(jié)其菌懸液濃度為107CFU/mL,菌懸液中加入濃度為1 mg/mL的ZEN 毒素母液,使毒素的終濃度為4 μg/mL,28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h,4 ℃、12000 r/min 條件下離心15 min,上清液用孔徑為0.45 μm 細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾,利用HPLC 檢測(cè)上清液中的峰面積,3 次重復(fù),以不加菌懸液的含等量毒素的DF 培養(yǎng)基為對(duì)照(CK),將峰面積代入所建立的ZEN 毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算溶液中毒素濃度和去除率,如去除率達(dá)到100%,再增加菌懸液中毒素含量[26]。

      去除率(%)=(CK 毒素濃度?樣品中毒素濃度)/CK 毒素濃度×100

      1.2.3 BMF04 菌株去除ZEN 毒素的作用機(jī)理研究

      1.2.3.1 BMF04 菌株去除ZEN 毒素方式研究 將活化18 h 的BMF04 菌株斜面用5 mL PD 洗下制成菌懸液,倒入裝有55 mL 種子液培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h,發(fā)酵液于4 ℃、8000 r/min 離心15 min,分別收集發(fā)酵上清液和菌體沉淀。上清液過(guò)濾除菌得到無(wú)菌發(fā)酵液;將菌體沉淀用DF 培養(yǎng)基洗滌3 次,用等體積DF 培養(yǎng)基重懸菌體得到活菌懸浮液,菌體密度為107CFU/mL。無(wú)菌發(fā)酵液和活菌懸浮液121 ℃滅菌30 min,得到滅活無(wú)菌發(fā)酵液和滅活菌懸浮液;活菌懸浮液用超聲細(xì)胞破碎儀處理,至菌體充分破碎,冰浴功率比20%,工作時(shí)間為3 s,間隙時(shí)間5 s,循環(huán)工作至活菌懸浮液呈透明狀,4 ℃,8000 r/min,離心15 min,分別收集上清液和沉淀,上清液用0.45 μm 濾膜過(guò)濾,濾液為胞內(nèi)液;沉淀為細(xì)胞壁組分,用等量DF 培養(yǎng)基重懸,得到細(xì)胞壁懸浮液。取BMF04 菌株活菌懸浮液、滅活菌懸浮液、無(wú)菌發(fā)酵液、滅活無(wú)菌發(fā)酵液、胞內(nèi)液和細(xì)胞壁懸浮液,分別加入ZEN 毒素母液,使ZEN 毒素終濃度為15 μg/mL,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h,測(cè)定不同處理的峰面積,計(jì)算不同樣品中ZEN 毒素濃度和去除率[27]。

      1.2.3.2 蛋白酶對(duì)BMF04 菌株去除ZEN 毒素作用的影響 BMF04 菌株的無(wú)菌發(fā)酵液中,分別加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K,使酶的終濃度為1 mg/mL,用2 mol/L 的HCl 和NaOH 溶液調(diào)節(jié)胰蛋白酶反應(yīng)體系pH 為7.6、胃蛋白酶為pH2.0、蛋白酶K 為pH8.7,37 ℃水浴2 h,調(diào)回初始pH。取不同蛋白酶酶解后的樣品,加入ZEN 毒素母液,ZEN 毒素終濃度為4 μg/mL,28 ℃靜置12 h,采用HPLC的方法檢測(cè)樣品中ZEN 毒素峰面積,計(jì)算不同蛋白酶處理的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)ZEN 毒素的降解率。以未加蛋白酶的無(wú)菌發(fā)酵液為對(duì)照(CK1),未加無(wú)菌發(fā)酵液為空白對(duì)照(CK2),每種蛋白酶為1 處理,每個(gè)處理3 次重復(fù)[28?29]。

      1.3 數(shù)據(jù)處理

      實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次,使用SPSS 22.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,差異顯著性采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較(P<0.05),利用Microsoft Excel進(jìn)行圖形繪制。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 BMF04 菌株及無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

      BMF04 菌株和無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用(圖1)。BMF04 菌株對(duì)兩種病原菌的抑菌帶寬度分別為(25.73±1.42)mm 和(26.80±1.31)mm,無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)兩種病原菌的抑菌圈直徑分別為(14.67±2.52)mm和(15.00±1.00)mm,表明該菌株與無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌都具有較強(qiáng)的抑制作用。

      圖1 BMF04 菌株及無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of strain BMF04 and its aseptic fermentation broth on F.graminearum and F.nivale (Fr) Ces

      2.2 BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素去除作用的定性測(cè)定

      BMF04 菌株和陽(yáng)性對(duì)照GM-1-2 菌株在含ZEN毒素平板上生長(zhǎng)良好(圖2),陰性對(duì)照大腸桿菌(E.coli)不生長(zhǎng),說(shuō)明BMF04 菌株能夠在以ZEN 毒素為唯一碳源的DF 培養(yǎng)基上生長(zhǎng),具有去除ZEN 毒素的作用。

      圖2 不同菌株在含ZEN 毒素平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.2 The growth state of different strains on ZEN plate

      2.3 BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素降解的定量測(cè)定

      2.3.1 ZEN 毒素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè) 由圖3可知,ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間約為2.689 min,峰型清晰無(wú)拖尾,與其他的峰沒(méi)有重合,能夠清晰地測(cè)量出相應(yīng)的峰面積。表明該檢測(cè)方法可用于ZEN 毒素的檢測(cè)。

      圖3 ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 檢測(cè)圖譜Fig.3 HPLC analysis map of ZEN standard substance

      2.3.2 ZEN 毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配制不同梯度濃度的ZEN 毒素溶液,利用HPLC 測(cè)定其毒素的峰面積,以ZEN 毒素濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制ZEN 標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。結(jié)果表明,在0~16 μg/mL濃度范圍內(nèi),峰面積隨著ZEN 毒素濃度的增加而逐漸增大,呈正相關(guān),標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=82.727x+1.2333,R2為0.9996,線性相關(guān)性較好。

      圖4 ZEN 毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of ZEN

      2.3.3 BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素去除率的測(cè)定 HPLC檢測(cè)ZEN 毒素初始濃度為4、10 和15 μg/mL 的對(duì)照峰面積分別為(323.28±5.69)、(818.29±4.74)和(1234.68±24.83),加標(biāo)回收率分別為97.25%±1.75%、98.80%±0.60%和99.40%±2.00%,與加入的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品初始濃度擬合程度較高,說(shuō)明儀器靈敏度好,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。將BMF04 菌株接種到ZEN 毒素終濃度為4 和10 μg/mL 的DF 培養(yǎng)液中,28 ℃培養(yǎng)48 h,HPLC 檢測(cè)ZEN 毒素未出現(xiàn)吸收峰,說(shuō)明該濃度下BMF04 菌株能完全降解ZEN 毒素,去除率為100%;當(dāng)增加ZEN 毒素濃度為15 μg/mL,檢測(cè)到ZEN 毒素峰面積為(12.96±0.14),ZEN 毒素濃度為(0.14±0.01)μg/mL,去除率仍為98.95%±1.27%(表1)。說(shuō)明BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素具有較強(qiáng)的去除能力。

      表1 BMF04 菌株對(duì)不同濃度ZEN 毒素的去除率Table 1 Removal rate of BMF04 strain to different concentration of ZEN

      2.4 BMF04 菌株去除ZEN 毒素的機(jī)理研究

      2.4.1 BMF04 菌株活菌懸液和滅活菌懸液對(duì)ZEN 毒素的去除作用 BMF04 菌株活菌懸液在含15 μg/mL ZEN 毒素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,HPLC 檢測(cè)峰面積為(14.29±0.77),濃度為(0.16±0.01)μg/mL,去除率為98.92%±0.07%;滅活菌懸液峰面積和毒素濃度分別(488.92±2.38)和(5.90±0.03)μg/mL(表2),去除率為60.32%±0.21%,比菌株活菌懸液的峰面積和毒素濃度明顯下降,差異顯著(P<0.05),說(shuō)明去除ZEN 毒素作用是活菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生了具有去除ZEN 毒素作用的活性物質(zhì),高溫處理后活性物質(zhì)失活,導(dǎo)致去除率降低[30],高溫滅活后細(xì)胞壁依然存在,滅活后活菌的去除作用消失,細(xì)胞壁的吸附作用受溫度影響較小,因而滅活后仍然具有一定的去除率,表明BMF04菌株對(duì)ZEN 毒素的去除作用是菌株產(chǎn)生活性物質(zhì)和細(xì)胞壁吸附的共同作用。

      2.4.2 BMF04 菌株無(wú)菌發(fā)酵液和滅活無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)ZEN 毒素的去除作用 無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)121 ℃高溫處理后與無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)ZEN 毒素的去除作用差異顯著(P<0.05),明顯降低(表2)。無(wú)菌發(fā)酵液與濃度為15 μg/mL 的ZEN 毒素溶液混合培養(yǎng)48 h 后,HPLC 檢測(cè)峰面積為(17.3±2.22),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ZEN 毒素濃度僅為(0.19±0.03)μg/mL,去除率達(dá)98.70%±0.19%;發(fā)酵液高溫處理后再與毒素溶液混合培養(yǎng)48 h,HPLC 檢測(cè)峰面積為(1204.75±36.29),ZEN 毒素濃度為(14.55±0.44)μg/mL(表2),去除率僅為2.09%±1.15%,去除率顯著下降(P<0.05)。說(shuō)明BMF04 菌株胞外物質(zhì)對(duì)ZEN 毒素具有去除作用,且高溫處理影響其去除作用。

      表2 不同處理BMF04 菌株ZEN 毒素的峰面積和濃度Table 2 Peak area and concentration of ZEN by strain BMF04 with different treatments

      2.4.3 BMF04 菌株細(xì)胞壁懸浮液和胞內(nèi)液對(duì)ZEN毒素的去除作用 細(xì)胞壁懸浮液和胞內(nèi)液在含15 μg/mL ZEN 毒素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,測(cè)定上清液中毒素含量,計(jì)算去除率。結(jié)果表明,經(jīng)細(xì)胞壁懸浮液處理的樣品峰面積分別為(27.91±0.98),ZEN 毒素濃度為(0.32±0.01)μg/mL,去除率為97.85%±0.07%(表2),說(shuō)明BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素的去除作用有細(xì)胞壁吸附的作用。經(jīng)胞內(nèi)液處理的樣品峰面積為(19.12±1.06),ZEN 毒素濃度為(0.22±0.02)μg/mL,去除率為98.54%±0.10%(表2),表明BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素的去除作用也有菌株產(chǎn)生的胞內(nèi)活性物質(zhì)的作用。

      2.4.4 蛋白酶處理對(duì)無(wú)菌發(fā)酵液去除解ZEN 毒素作用的影響 無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K 處理后對(duì)ZEN 毒素的去除作用明顯降低,差異顯著(P<0.05),反應(yīng)體系中ZEN 毒素濃度分別為(3.83±0.03)、(3.95±0.02)和(3.96±0.00)μg/mL(表3),對(duì)應(yīng)的去除率分別為3.52%±0.77%、0.50%±0.39%和0.18%±0.12%,未處理無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)照Z(yǔ)EN 毒素峰面積為(45.44±2.37),濃度為(0.53±0.03)μg/mL,去除率為86.54%±0.72%(表3),3 種酶處理后對(duì)毒素的去除作用與對(duì)照CK1 差異顯著(P<0.05),胃蛋白酶和蛋白酶K 之間差異不顯著,其中胃蛋白酶和蛋白酶K 對(duì)BMF04菌株無(wú)菌發(fā)酵液去除ZEN 毒素的影響強(qiáng)于胰蛋白酶。表明胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K 能降低BMF04 菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)ZEN 毒素的去除作用,進(jìn)一步說(shuō)明BMF04 菌株去除ZEN毒素的胞外活性物質(zhì)為蛋白類(lèi)物質(zhì)。

      表3 不同蛋白酶處理BMF04 菌株無(wú)菌發(fā)酵液后ZEN毒素的峰面積、濃度和去除率Table 3 Peak area and concentration of ZEN culture medium after different protease treatment of aseptic fermentation broth

      3 討論與結(jié)論

      不同解毒微生物菌株對(duì)ZEN 毒素的降解作用和機(jī)理不同,Cho 等[17]從土壤中分離出一株降解ZEN 毒素的枯草芽孢桿菌(B.subtilis),對(duì)液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中含1 和0.25 mg/kg ZEN 毒素的降解率分別為99%和95%;Yi 等[31]從土壤中分離得到一株能降解ZEN 毒素的地衣芽孢桿菌,在ZEN 毒素濃度為2 mg/kg 的LB 培養(yǎng)基中對(duì)降解率為95.8%;譚輝[32]從牛瘤胃中分離純化到假單胞屬(Pseudomonas)菌株TH-N 1,在培養(yǎng)基中含2 μg/mL ZEN 毒素時(shí)降解率為59%;Saumuel 等[20]分離出一株假單胞菌(Pseudomonassp.),在培養(yǎng)基中含0.2 μg/mL ZEN 毒素時(shí)對(duì)其降解率為90%以上。不同降解毒素菌株中芽孢菌屬降解ZEN 毒素的能力較強(qiáng)[18,33],張晨曦等[34]篩選獲得一株解淀粉芽孢桿菌NS2 對(duì)5 μg/mL ZEN 的降解率高達(dá)95.99%。BMF04菌株在ZEN 毒素濃度為15 μg/mL 時(shí),去除率仍可達(dá)為98.95%,對(duì)ZEN 毒素的去除作用明顯高于已有菌株。

      不同微生物菌株降解ZEN 毒素的方式、活性物質(zhì)種類(lèi)不同。王國(guó)兵[35]和Xu 等[36]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽抱桿菌ZDS-1 和香茅醇假單胞ASAG16 對(duì)ZEN毒素的去除作用是降解作用,降解過(guò)程中,沒(méi)有產(chǎn)生ZEN 的類(lèi)似物,不是簡(jiǎn)單的結(jié)合或吸收作用;耿海榮等[18]研究表明枯草芽孢桿菌(B.subtilis)Y-33 的菌液對(duì)2 和20 μg/mL ZEN 毒素降解率分別為93.79%和82.40%,發(fā)酵上清液對(duì)ZEN 毒素降解率為62.02%,說(shuō)明該菌株降解ZEN 毒素活性成分存在于發(fā)酵上清液中;譚輝[32]對(duì)菌株TH-N 1 的降解機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)活菌體細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)含物對(duì)ZEN 的降解率分別為59%和38%,無(wú)菌的上清液和滅活后的菌液對(duì)ZEN 毒素?zé)o降解作用,說(shuō)明其降解作用可能是由于細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)酶的作用。唐彧等[37]研究認(rèn)為谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamate)406 降解ZEN和AFB1 活性成分存在于發(fā)酵上清液中,降解率分別為50%和58%,初步確定其降解活性物質(zhì)為一種胞外酶,而不是基于細(xì)胞壁的吸附作用。本研究結(jié)果表明BMF04 菌株對(duì)ZEN 毒素的去除作用既有細(xì)胞壁吸附作用又有蛋白質(zhì)的參與,但有關(guān)降解毒素的活性物質(zhì)種類(lèi)待于進(jìn)一步研究。

      BMF04 菌株及無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)均具有良好的抑制作用,通過(guò)細(xì)胞壁的吸附、胞內(nèi)物質(zhì)和胞外蛋白的降解對(duì)ZEN 毒素具有較強(qiáng)的去除作用,去除效果明顯高于已有菌株,該結(jié)果為菌株進(jìn)一步用于去除污染糧食、飼料中的ZEN 毒素提供了新的菌種資源和理論依據(jù)。

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