木姜子和忍冬藤配伍醇提物影響哮喘小鼠ASMC增殖與氣道重塑的效果

竇玉玉，藍(lán)凰齊，郭建宏，黃寶琳，李克明，唐漢慶，王露瑤

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

哮喘是嚴(yán)重威脅人們健康的常見變態(tài)反應(yīng)性疾病，氣道重塑是哮喘主要病理特征之一[1]。氣道重塑是指氣道壁結(jié)構(gòu)的病理性改變，其中，氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cell，ASMC)病理改變是氣道壁增厚和結(jié)構(gòu)異常的重要因素，ASMC 病理改變在氣道重塑發(fā)生機(jī)制中具有重要作用。氣道重塑的結(jié)果導(dǎo)致慢性氣道梗阻和持續(xù)性的氣道高反應(yīng)性，是哮喘進(jìn)展的重要原因。因此，從改善ASMC病理變化從而抑制氣道重塑為緩解哮喘進(jìn)展提供了治療思路。

木姜子和忍冬藤屬于壯族醫(yī)藥中的常用藥物，兩藥相伍用乙醇浸泡民間用于減輕哮喘發(fā)作，對于木姜子和忍冬藤配伍用于緩解哮喘，是否通過改善ASMC的增殖、抑制氣道重塑而起效，其分子生物學(xué)機(jī)制目前研究不多。本研究工作通過建立哮喘小鼠模型，觀察木姜子和忍冬藤配伍醇提物減輕哮喘小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的作用及探討其可能的起效機(jī)制，為其應(yīng)用進(jìn)一步提供基礎(chǔ)研究的相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 AE160型電子天平(瑞士Mettler公司生產(chǎn))；DU530型紫外分光光度儀(美國Beckman公司生產(chǎn))；MK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo Labsystem公司生產(chǎn))；RM2245型切片機(jī)(上海萊卡顯微系統(tǒng)有限公司生產(chǎn))；402B型超聲霧化器(上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn))；PowerPac HC 型電泳儀(美國伯樂公司生產(chǎn))；chemidoc XRS型凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司生產(chǎn))；TEC2602型恒溫烘片機(jī)(意大利Histo-line公司生產(chǎn))；CK41-32PH型顯微鏡(日本Olympus公司生產(chǎn))。

1.2 藥材 木姜子飲片(購于廣西仁濟(jì)堂中藥飲片公司，批號：151101)；忍冬藤飲片(購于廣西張益堂中藥飲片有限公司，批號：1602092)；此2味藥材是廣西壯族地區(qū)應(yīng)用較久的壯藥[2]。

1.3 藥品與試劑 細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)檢測試劑盒(伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：HJ0021SDF202001);細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，批號：1913633237)；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板源生長因子(PDGF)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號分別為190828、191502、185426、185624、187985)；卵清蛋白(OVA)(美國Solarbio公司生產(chǎn)，批號：1218B031)；氫氧化鋁(美國Thermo公司生產(chǎn)，批號：SG252318)；蘇木精、伊紅(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號：A10034、A10022)。

1.4 動物 健康清潔級昆明種小鼠50只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK桂2017-0004。所有小鼠均分籠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 木姜子和忍冬藤配伍醇提物的制備 將木姜子和忍冬藤按照質(zhì)量比1∶1比例，放到適量70%食用乙醇里浸泡1周，再放入回流裝置中，加熱回流1 h，過濾，濾渣再加入適量的70%乙醇，再次加熱回流1 h，過濾后合并兩次濾液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇并濃縮，濃縮液放入真空干燥箱70℃干燥，得到乙醇提取物粉末。使用時量取乙醇提取物粉末溶于蒸餾水，配制成濃度2 mg/ml。

1.6 分組、造模與給藥 將小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，木姜子和忍冬藤配伍醇提物低、中、高劑量組共5組，每組10只。參考文獻(xiàn)[3]造模方法。除空白組外，其他各組分別在實驗第1天、第8天腹腔注射OVA致敏液0.5毫升/只(含5 mg OVA和15 mg氫氧化鋁)進(jìn)行致敏；實驗第15天開始激發(fā)，將小鼠放入30 cm×30 cm×30 cm自制透明霧化箱中，每日通過霧化管向箱中噴入1% OVA 30 min，霧量控制為0.5 ml/min，連續(xù)7 d?？瞻捉M的致敏液和激發(fā)均以生理鹽水代替；實驗第23天起，低、中、高劑量組每天分別按照5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg給予木姜子和忍冬藤的醇提物灌胃，空白組和模型組給予等量的生理鹽水。每天1次，連續(xù)干預(yù)7 d，干預(yù)結(jié)束后取材檢測指標(biāo)。

1.7 TGF-β1、IL-4、IL-13、VEGF 、PDGF水平檢測 各組小鼠末次干預(yù)后2 h，心臟取血，離心(4℃，2000 r/pm，10 min)，取上清液，置于-20℃低溫保存，待檢。采用ELISA法檢測TGF-β1、IL-4、IL-13、VEGF 、PDGF水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.8 肺組織形態(tài)學(xué)變化觀察 各組小鼠心臟取血后，取左肺組織以生理鹽水洗凈，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度5 μm)，常規(guī)脫蠟復(fù)水后，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.9 Cyclin D1、ERK1/2蛋白表達(dá)檢測 各組小鼠心臟取血后，取右肺組織，加入適量預(yù)冷生理鹽水中，勻漿，離心(4℃，4000 r/pm，10 min)，取上清液，經(jīng)過蛋白定量、蛋白變性、制膠、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入Cyclin D1、ERK1/2一抗(1∶800)，4℃孵育過夜；再加入二抗(1∶2000)，室溫下孵育1 h， Western blot法檢測，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用凝膠系統(tǒng)拍攝圖像，用ImageJ 1.48圖像分析軟件分析所得蛋白條帶的灰度值(條帶面積×條帶密度)，并以β-actin 為內(nèi)參對照，目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達(dá)量，以相對表達(dá)量表示各組Cyclin D1、ERK1/2蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1、IL-4、IL-13、VEGF、PDGF蛋白水平檢測結(jié)果 與空白組比較，模型組TGF-β1、IL-4、IL-13、VEGF 、PDGF蛋白水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，低、中、高各劑量組TGF-β1、IL-4、IL-13、VEGF 、PDGF蛋白水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見表1。

2.2 肺組織形態(tài)學(xué)變化觀察 空白組肺組織、支氣管清晰，管壁連續(xù)均勻、內(nèi)壁光滑，無血管充血及炎癥細(xì)胞浸潤；模型組肺組織、支氣管結(jié)構(gòu)不清、管壁不光滑、有大片炎癥細(xì)胞浸潤；低、中、高各劑量組肺泡間隔增厚不明顯，肺泡滲出物較少，黏膜下及肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤程度較模型組減輕，見圖1。

2.3 Western blot 法對Cyclin D1、ERK1/2蛋白表達(dá)檢測結(jié)果 與空白組比較，模型組Cyclin D1、ERK1/2蛋白表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，低、中、高各劑量組Cyclin D1、ERK1/2蛋白表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

注：箭頭代表肺間隔增厚。圖1 各組肺組織形態(tài)學(xué)變化圖(HE染色，×200)

表2 各組Cyclin D1、ERK1/2蛋白表達(dá)比較

3 討論

氣道重塑在一些肺病變?nèi)缦⒙宰枞苑渭膊≈谐Ｒ?，作為哮喘的特征性病理改變之一，其主要表現(xiàn)為氣道壁增厚、黏液高分泌狀態(tài)、杯狀細(xì)胞化生及增生、網(wǎng)狀基底膜增厚、基質(zhì)沉積、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等[4]。

氣道重塑是引起哮喘反復(fù)發(fā)作、病程遷延的重要原因，氣道重塑的持續(xù)發(fā)展，導(dǎo)致患者的病情惡化，引發(fā)治療的復(fù)雜和困難[5]，其中，氣道壁增厚是氣道重塑的主要表現(xiàn)之一，是引起不可逆性通氣功能障礙[6]、氣道反應(yīng)性持續(xù)增高[7]、肺功能進(jìn)行性降低[8]的重要因素。ASMC 病理改變是氣道壁增厚和結(jié)構(gòu)異常的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[9]。因此，ASMC 病理變化在氣道重塑的發(fā)生機(jī)制中扮演重要角色，靶向干預(yù)ASMC病理變化從而抑制氣道重塑成為潛在的治療哮喘的策略。

近來研究表明ASMC 增殖是引起氣管狹窄和氣道重塑的顯著因素[10]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases 1 and 2，ERK1/2)通路是引起ASMC 增殖的重要通路，哮喘體內(nèi)處于DNA 合成期和有絲分裂期的ASMC 比例顯著增加，表明ASMC 處于過度增殖狀態(tài)，最終導(dǎo)致氣道壁增厚、氣道平滑肌收縮力增強(qiáng)，是引起哮喘氣道重塑及氣道反應(yīng)性增高的重要原因，與Cyclin D1表達(dá)有關(guān)。研究顯示IL-4、IL-13炎癥因子通過ERK1/2 通路與ASMC上的相應(yīng)受體結(jié)合，促進(jìn)ASMC的增殖，是與氣道重塑相關(guān)值得關(guān)注的重要細(xì)胞因子[11]。研究結(jié)果證明通過抑制IL-4、IL-13炎癥因子以及Cyclin D1功能，可緩解氣道炎癥，減輕PDGF誘導(dǎo)的ASMC 增殖，因而IL-4、IL-13、PDGF因子水平及表達(dá)可以反映ASMC 增殖程度，為哮喘治療提供分子靶點(diǎn)[12]。

氣道重塑進(jìn)程中，ASMC 處于過度增殖的活躍期，具有旺盛的合成、分泌多種因子的功能[13]，ERK1/2 通路影響TGF-β1、VEGF的合成和分泌，參與調(diào)控ASMC 過度增殖。研究[14]提示其中的TGF-β1參與了哮喘的氣道重塑，另外研究[15]表明PDGF是一種重要的促有絲分裂因子，刺激哮喘ASMC 增殖。

木姜子和忍冬藤是常用的壯藥，現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為木姜子具有止咳平喘、解痙鎮(zhèn)攣等作用，在抗炎[16]、提高機(jī)體免疫功能方面[17]有較好作用。忍冬藤具有抗炎[18]、抗氧化[19]、提高免疫功能[20]、舒張平滑肌作用[21-22]。木姜子和忍冬藤配伍可以加強(qiáng)抗炎、止咳平喘、解痙鎮(zhèn)攣的功效。在本實驗工作中，觀察到哮喘模型組Cyclin D1、ERK1/2蛋白表達(dá)以及TGF-β1、IL-4、IL-13、VEGF 、PDGF水平均升高，表明哮喘ASMC的增殖處于活躍狀態(tài)，是氣道重塑的進(jìn)展表現(xiàn)；同時，肺組織形態(tài)學(xué)觀察到模型組有大片炎癥細(xì)胞浸潤，因此，需要抑制ASMC的增殖和抗炎，從而緩解氣道重塑的進(jìn)展。本實驗采用木姜子和忍冬藤配伍醇提物進(jìn)行干預(yù)后，注意到Cyclin D1、ERK1/2蛋白表達(dá)以及TGF-β1、IL-4、IL-13、VEGF 、PDGF水平較模型組均有不同程度的降低，同時肺組織形態(tài)學(xué)觀察到炎癥細(xì)胞浸潤較模型組減輕，顯示了較好地降低ASMC增殖相關(guān)因子水平和抗炎作用。

本實驗工作顯示，木姜子和忍冬藤配伍醇提物可降低IL-4、IL-13炎癥因子水平，抑制ERK1/2 通路中的Cyclin D1、ERK1/2 表達(dá)，進(jìn)而降低TGF-β1、VEGF 、PDGF水平從而抑制ASMC的增殖緩解哮喘氣道重塑進(jìn)程，推測可能是其起效的環(huán)節(jié)之一。