自體培養(yǎng)組織工程表皮移植治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)初步臨床研究

谷曉廣 刁云珍 劉永生 續(xù)言鳳 高丹旭

[摘要]目的：探討自體培養(yǎng)組織工程表皮移植治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)的臨床療效。方法：收集皮膚科10～48歲穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者42例，切取患者正常皮膚（約2cm×3cm），通過酶解、消化并培養(yǎng)形成自體培養(yǎng)組織工程表皮。然后將培養(yǎng)的組織工程皮膚移植到患者白斑處，并進(jìn)行縫合固定、加壓包扎。1周后縫合處拆線、2周后拆除油紗。術(shù)后對患者進(jìn)行隨訪，并用臨床照片、輔以Wood燈分析色素恢復(fù)情況，記錄復(fù)色情況，評價治療效果。結(jié)果：2014年10月-2019年4月通過自體培養(yǎng)組織工程表皮移植治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者42例，隨訪12個月，結(jié)果顯示自體培養(yǎng)組織工程表皮移植治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)整體有效率為83.3%，其中頭面部有效率最高為94.7%，其次為軀干部皮損為90.9%、四肢的有效率最低為76.2%。頭面部治療有效率明顯高于四肢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：自體培養(yǎng)組織工程表皮移植治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)效果明顯，療效確切，安全性高。

[關(guān)鍵詞]白癜風(fēng);穩(wěn)定期白癜風(fēng);黑素細(xì)胞;組織工程表皮;皮膚移植;自體移植

[中圖分類號]R758.4+1? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）04-0106-04

Preliminary Clinical Study of Autologous Culture Tissue Engineering Epidermal Grafting in the Treatment of Stable Vitiligo

GU Xiao-guang1，2，DIAO Yun-zhen3，LIU Yong-sheng1，2，XU Yan-feng1，2，GAO Dan-xu1，2

（1.Department of Dermatology，? Aviation General Hospital，Beijing 100021，China;2.Beijing Translational Medicine Research Institute of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100021，China;3.Beijing Airmet Biotechnology Co.，Ltd.Beijing 100094，China）

Abstract： Objective? To investigate the clinical efficacy of autologous culture tissue engineering epidermal grafting in the treatment of stable vitiligo. Methods? A total of 42 patients with stable vitiligo of 10-48 years old were enrolled in the dermatology department. Cutted the patients normal skin （approximately 2cm×3cm）， and form autologous culture tissue engineering epidermis through enzymolysis， digestion and culture. Then the cultured tissue engineered skin is transplanted to the patient's leukoplakia， sutured， fixed， and pressure bandaged. after 1 week， the stitches were removed from the suture， and the oil gauze was removed after 2 weeks. After the operation， the patients were followed up， and the clinical photos were used to analyze the recovery of the pigment with the aid of the Wood lamp， and the recolor situation was recorded to evaluate the treatment effect. Results? From October 2014 to April 2019， our department treated 42 patients with stable vitiligo through autologous culture tissue engineering epidermal grafting， and followed up for 12 months. The results showed that the overall effective rate of vitiligo in the stable period of autologous cultured tissue engineering was 83.3%， with the highest head and face efficiency of 94.7%， followed by the trunk lesions of 90.9% and the limbs with the lowest efficiency of 76.2%. The effective rate of head and face was significantly higher than that of limbs， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion? Autologous cultured tissue engineering epidermal transplantation has obvious effects in the treatment of stable vitiligo， with definite curative effect and high safety.

Key words： vitiligo; stable vitiligo; melanocytes; tissue engineering epidermis; skin grafting; autotransplantation

白癜風(fēng)是一種常見的后天性色素脫失性皮膚黏膜疾病，臨床表現(xiàn)為身體局部出現(xiàn)白斑，隨著病情進(jìn)展白斑面積逐漸擴(kuò)大，部分患者可逐漸進(jìn)展為全身彌漫白斑[1]。白癜風(fēng)的發(fā)病機制目前不十分清楚，治療比較困難，雖然治療方法多樣，但有時療效不盡人意。而利用自體培養(yǎng)組織工程表皮治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)，可以為患者表皮移植提供供體，成為白斑面積較大的白癜風(fēng)患者治療的新選擇。從2014年開始，筆者科室開展自體培養(yǎng)組織工程表皮移植治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)的研究，取得了非常滿意的臨床效果，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1? 資料和方法

1.1 臨床資料：收集2014年10月-2019年4月穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者42例為研究對象，男16例，女26例，年齡10～48歲（24.3±11.2）歲，平均病程12年，病期參照VIDA評分標(biāo)準(zhǔn)，均為穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者，穩(wěn)定期時間1～10年，平均穩(wěn)定期5年，其中節(jié)段型24例，尋常型[1]（原非節(jié)段型）13例，未定類型（原局限型）5例。

1.2 自體培養(yǎng)組織工程表皮的制備：患者正常皮膚處浸潤麻醉，手術(shù)切取患者該處正常皮膚（大約2cm×3cm），無菌條件下送GMP潔凈實驗室。本文組織工程表皮制備利用改良的Green方法由北京艾美特夫生物科技有限公司提供，具體培養(yǎng)步驟如下：取下的全層皮膚首先進(jìn)行進(jìn)一步消毒后，用胰酶蛋白酶等消化，獲得表皮組織懸液后，計數(shù)，計算活細(xì)胞率?；罴?xì)胞率通常在90%以上。將這些細(xì)胞用配制的表皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基混勻后，均勻地播種在培養(yǎng)皿中，靜置在二氧化碳培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)后第1天觀察表皮細(xì)胞的貼附著和克隆生長狀態(tài)。培養(yǎng)過程中每2～3d更換新的培養(yǎng)基。臨床患者的需求一般在50～200cm2的培養(yǎng)表皮，培養(yǎng)天數(shù)通常為14～21d。2～3周后，表皮細(xì)胞增殖到一定數(shù)量，細(xì)胞之間形成連接，并分化增厚成2～5層的層狀表皮。培養(yǎng)表皮中均勻分布著黑素細(xì)胞（黑素細(xì)胞與表皮細(xì)胞百分比約為7%～18%）。在患者指定的手術(shù)日，用水解酶將培養(yǎng)表皮細(xì)胞層從培養(yǎng)皿上取下，清洗后轉(zhuǎn)移到運輸容器中，無菌條件下運抵手術(shù)室待用。

1.3 自體培養(yǎng)組織工程表皮的移植：移植當(dāng)天，將培養(yǎng)成形的表皮從培養(yǎng)皿中剝離，用磷酸緩沖溶液洗凈以備移植用;患者皮損處用1%利多卡因、羅哌卡因、1%腎上腺素混合局部麻醉后，用電動皮膚磨削機對患處皮膚表層磨削。將培養(yǎng)表皮的基底膜面著磨削區(qū)域覆蓋;將涂有抗菌軟膏的油紗布（非粘貼性紗布）覆蓋于移植部位后進(jìn)行固定縫合;用紗布固定，以防止手術(shù)部位被拉動。移植1周后，拆線、替換保護(hù)用固定紗布;移植2周后，移除非粘貼性紗布，避免陽光曝曬。移植后的第1、3、6、12個月隨訪觀察，數(shù)碼相機拍照記錄，部分患者輔以Wood燈分析色素恢復(fù)狀況，記錄復(fù)色情況及不良反應(yīng)。

1.4 療效評價：治療前后及治療過程中拍照記錄，采用AdobePhotoshop 7.0圖像軟件系統(tǒng)測復(fù)色面積。療效標(biāo)準(zhǔn)：痊愈為色素恢復(fù)100%;臨床痊愈為色素恢復(fù)>90%（臨床近距離表現(xiàn)為輕度鵝卵石樣外觀或個別地方未復(fù)色，整體復(fù)色>90%）;顯效為色素恢復(fù)60%～89%;好轉(zhuǎn)為色素恢復(fù)25%～60%;無效為復(fù)色面積<25%皮損面積。有效率=痊愈率+顯效率。痊愈率=（痊愈+臨床痊愈）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組間差異比較采用χ2檢驗。

2? 結(jié)果

移植1～2個月時局部顯示粉紅色，Wood燈顯示色素附著;移植6個月時局部色素逐漸恢復(fù)正常，部分患者1年時仍可見色素恢復(fù)。所有病例隨訪最少6～12個月，最長隨訪40個月，未發(fā)現(xiàn)瘢痕及產(chǎn)生的色素出現(xiàn)色素脫失現(xiàn)象;小部分患者配合局部外用他克莫司軟膏或輔以低能量311nm窄譜中波紫外線或308nm準(zhǔn)分子光治療，個別患者治療部位顯示有輔助色素恢復(fù)作用。

42例不同臨床分型患者療效：24例節(jié)段型患者中痊愈率為41.7%（10/24），有效率為75.0%（18/24）。13例尋常型（原非節(jié)段型）患者中痊愈率為69.2%（9/13），有效率為92.3%（12/13）。5例未定類型（原局限型）患者中痊愈率為60.0%（3/5），有效率為100.0%（5/5）。通過上結(jié)果顯示該技術(shù)對不同類型患者的治療有效率均達(dá)到75%以上，整體有效率為83.3%，顯示了非常好的療效，見表1。

62處不同部位皮損治療效果：42例患者共62塊皮損，其中痊愈、臨床痊愈28處（45.2%），顯效26處（41.9%），好轉(zhuǎn)7處（11.3%），無效1處（1.6%），有效率為87.1%。其中頭面部有效率最高為94.7%，其次為軀干部皮損為90.9%、四肢的有效率最低為76.2%，頭面部治療有效率與四肢治療有效率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）

3? 討論

白癜風(fēng)是一種后天性的局限性或泛發(fā)性的皮膚色素脫失性皮膚病。臨床表現(xiàn)為身體局部出現(xiàn)白斑，隨著病情進(jìn)展白斑面積逐漸擴(kuò)大，部分患者可逐漸進(jìn)展為全身彌漫白斑。是一種慢性并且極其影響患者容貌的皮膚病[2]。白癜風(fēng)的病因尚不清楚，近年研究顯示：①組織學(xué)及免疫細(xì)胞學(xué)顯示白癜風(fēng)表皮黑素細(xì)胞消失，活動性白斑邊緣的真皮內(nèi)有淋巴細(xì)胞浸潤;②患者血清中存在抗黑素細(xì)胞抗體，且滴度與病變的程度成正比;③將正常人皮膚移植到裸鼠，注射白癜風(fēng)患者IgG可使移植的皮膚出現(xiàn)白斑;④內(nèi)服或外用皮質(zhì)類固醇或其他免疫抑制劑能取得明顯療效[3]。這些發(fā)現(xiàn)表明白癜風(fēng)是一種與自身免疫密切相關(guān)的疾病。目前白癜風(fēng)的治療方法很多，可以用系統(tǒng)治療如口服激素、局部治療可以外用糖皮質(zhì)激素乳膏、鹽酸氮芥、局部或系統(tǒng)光化學(xué)療法、紫外線治療、外科手術(shù)自體皮膚移植等，但以上所有方法療效比較局限，部分患者對上述所有方法無效、導(dǎo)致白斑面積不斷發(fā)展[4]。

表皮細(xì)胞的成功培養(yǎng)觸發(fā)了組織工程皮膚研究的開端。1975年Rheinwald和Green采用3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，在體外成功連續(xù)培養(yǎng)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞[5]。1981年0Connor等首次將此種方法培養(yǎng)的自體表皮膜片（cultured epithelial autograft，CEA）用于燒傷創(chuàng)面的修復(fù)，獲得成功[6]。上述的研究表明燒傷后的色素減退可以通過皮膚移植而使該部位成功復(fù)色，進(jìn)一步證明了色素脫失性疾病可以通過組織工程表皮的移植而獲得復(fù)色的可能性。1997年，Kumagai和Uchikoshi[7]的研究顯示：通過Green方法而培養(yǎng)成功的自體表皮膜片，治療了6例包含白癜風(fēng)、斑駁病和白化病等的色素減退患者，全部獲得成功。自體培養(yǎng)組織工程表皮是從患者自身的皮膚組織分離出來的表皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，形成一到多層的膜片樣的組織，組織結(jié)構(gòu)近似于人的正常表皮組織[8]。該組織工程表皮的表皮細(xì)胞和黑素細(xì)胞均來源于患者自身正常皮膚[9]。然后通過對白癜風(fēng)患者白斑區(qū)域的皮膚磨削以及自體皮膚移植，把培養(yǎng)的組織工程表皮移植到患者白斑區(qū)域，加壓包扎，數(shù)周后該白斑區(qū)域達(dá)到很好的復(fù)色[10]。自體皮膚移植分為三類：含黑素細(xì)胞的正常皮膚（表皮或表皮和真皮）移植;非培養(yǎng)的含有黑素細(xì)胞的表皮或者毛囊移植;生長于附著物的培養(yǎng)的黑素細(xì)胞（含有或者不含有角質(zhì)形成細(xì)胞）移植[11-12]。有學(xué)者對自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞治療白癜風(fēng)進(jìn)行了深入研究，取得了較好的臨床效果。近年來我國學(xué)者已將組織工程皮膚培養(yǎng)[13-14]、自體黑素細(xì)胞培養(yǎng)、自體移植技術(shù)[15-16]應(yīng)用于臨床，并取得了很好的臨床效果。本研究通過自體培養(yǎng)組織工程表皮移植技術(shù)對募集的42例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者進(jìn)行治療，治療后通過臨床照片、輔以Wood燈分析色素恢復(fù)情況，對患者療效進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯示總的有效率達(dá)到83.3%，各個部位的有效率也進(jìn)行了相關(guān)統(tǒng)計，其中頭面部有效率最高達(dá)到了94.7%，其次為軀干部皮損為90.9%、四肢的有效率最低但是也達(dá)到了76.2%，該治療方法有效率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)治療方法，該治療方法對白癜風(fēng)各個部位復(fù)色的難易度與傳統(tǒng)方法相同，表明肢端白癜風(fēng)患者治療是非常困難的，但是與傳統(tǒng)方法想比該方法有效率仍達(dá)到76.2%，也顯示了其相對于傳統(tǒng)治療方法的優(yōu)越性。

研究顯示，自體培養(yǎng)組織工程表皮移植治療白癜風(fēng)效果明顯，治療面積大，復(fù)色均勻，值得臨床推廣應(yīng)用。這種方法對于那些藥物治療無效的穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者而言，是一種很好的選擇。

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[收稿日期]2020-05-14

本文引用格式：谷曉廣，刁云珍，劉永生，等.自體培養(yǎng)組織工程表皮移植治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)初步臨床研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，30（4）：106-109.