視網(wǎng)膜Sigma-1受體拮抗劑對豚鼠形覺剝奪性近視形成的抑制作用及其機制

陳媛媛 謝伏娟 李海波 關(guān)宇欣 毛俊峰

1中南大學湘雅醫(yī)院眼科中心 眼科學湖南省重點實驗室，長沙 410008；2中南大學湘雅醫(yī)院手術(shù)部，長沙 410008

Sigma-1受體是在豚鼠克隆的一種細胞內(nèi)分子伴侶，主要位于線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，具有調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道活性等生理功能[1]。Sigma-1受體表達于大多數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)層表達最為豐富，在Müller細胞、光感受器細胞、雙極細胞、無長突細胞均有表達[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，Sigma-1受體激活后與多巴胺轉(zhuǎn)運體(dopamine transporter，DAT)結(jié)合，抑制突觸間隙的多巴胺向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，造成細胞外多巴胺濃度升高[4]。目前的研究證實，視網(wǎng)膜多巴胺參與近視，尤其是形覺剝奪性近視(form deprivation myopia，F(xiàn)DM)的形成過程[5-6]。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DM豚鼠視網(wǎng)膜中多巴胺含量下降，腹腔內(nèi)注射左旋多巴能夠通過升高視網(wǎng)膜多巴胺含量抑制FDM形成[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DM豚鼠視網(wǎng)膜中多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量下降，調(diào)控視網(wǎng)膜多巴胺含量能夠影響豚鼠FDM的形成[8]。目前尚不清楚視網(wǎng)膜Sigma-1受體是否參與近視的形成，基于上述研究結(jié)果，我們推測視網(wǎng)膜Sigma-1受體可能通過調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜多巴胺含量而參與近視的形成。本研究擬探討視網(wǎng)膜Sigma-1受體在豚鼠FDM形成和恢復過程中的變化，并通過球周注射Sigma-1受體特異性拮抗劑N，N-二乙基-2-(4-甲氧基-3-苯乙基氧基苯基)乙胺鹽酸鹽(N,N-dipropyl-2-[4-methoxy-3-(2-phenylethoxy)-phenyl]-ethylaminemonohydrochloride，NE-100)觀察其對FDM形成及視網(wǎng)膜多巴胺含量的影響，研究視網(wǎng)膜Sigma-1受體在豚鼠FDM形成中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 選取健康21日齡三色豚鼠85只(中南大學實驗動物學部提供)，體質(zhì)量140～170 g，雌雄不限。本研究經(jīng)中南大學實驗動物學部倫理委員會批準(批文號：2020sydw0084)，實驗動物的使用和喂養(yǎng)完全遵循中國科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

1.1.2主要試劑及儀器 兔多克隆Sigma-1受體抗體(ab151288)、鼠抗兔GAPDH多克隆抗體(ab181603)、羊抗兔二抗(ab97051)(美國Abcam公司)；Sigma-1受體選擇性拮抗劑NE-100(SML0631，美國Sigma-Aldrich公司)；超敏兩步法免疫組織化學檢測試劑盒(PV-0023)、BCA蛋白定量試劑盒(C05-02001)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。ARK-510A電腦驗光角膜曲率計(日本尼德克公司)；MD-2400S眼科A/B型超聲診斷儀(天津邁達醫(yī)學科技股份有限公司)；艾沃斯-V8數(shù)字式照度計(武漢中測宏圖測量儀器有限公司)；KF-PRO-005全自動數(shù)字病理切片掃描儀(寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司)；Waters 2695型高效液相色譜儀、Waters uBondapak C18反相色譜柱(美國沃特世公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組處理 實驗分為2個部分進行，第1部分納入豚鼠36只，采用隨機數(shù)表法分為正常對照組、眼遮蓋14 d組和眼遮蓋11 d組，每組12只，其中正常對照組不予遮蓋，眼遮蓋14 d組用自制半透明眼罩連續(xù)遮蓋豚鼠右眼14 d作為FDM模型組，眼遮蓋11 d組同法連續(xù)遮蓋右眼11 d后去遮蓋3 d，評估視網(wǎng)膜Sigma-1受體在豚鼠FDM形成及恢復過程中的變化。另取49只豚鼠，采用隨機數(shù)表法將其分為FDM組10只、FDM+NE-100 6 μg組12只、FDM+NE-100 60 μg組10只、FDM+NE-100 600 μg組9只和FDM+生理鹽水組8只，研究阻斷視網(wǎng)膜Sigma-1受體活性對豚鼠FDM眼球屈光發(fā)育的影響。依據(jù)上述不同NE-100的作用結(jié)果，將NE-100 60 μg作為多巴胺測定實驗最適藥物計量，并比較FDM+NE-100 60 μg組與FDM組豚鼠實驗眼視網(wǎng)膜中多巴胺質(zhì)量分數(shù)的差異。

1.2.2豚鼠FDM模型的制作 在本課題組以前FDM模型制作方法[7,9]的基礎(chǔ)上制作豚鼠FDM模型。以右眼為遮蓋眼，以乳膠手套為材料制作半透明遮蓋眼罩，用系帶固定于豚鼠頭部。每日清洗眼罩1次，保持其清潔。分籠飼養(yǎng)，每天光照與黑暗周期為12 h/12 h，7：00—19：00為連續(xù)室內(nèi)日光燈照明時間，每天采用數(shù)字式照度計測量籠內(nèi)豚鼠眼水平面的光照度，控制在480～520 lx。按照預定實驗時間，采用電腦驗光角膜曲率計測定眼球相對屈光度和角膜曲率半徑(精確到0.01 mm)，A型超聲儀測量眼軸長度(精確到0.01 mm)，每眼測量3次，取平均值，評估眼球屈光狀態(tài)變化。于遮蓋后14 d，腹腔內(nèi)注射過量戊巴比妥鈉處死豚鼠，摘除眼球。

1.2.3免疫組織化學染色法檢測視網(wǎng)膜Sigma-1受體蛋白表達分布 正常對照組、眼遮蓋14 d組和眼遮蓋11 d組各任意選取3個標本，用2.5 ml一次性注射器針頭在角膜扎2～3個孔，將眼球置于質(zhì)量分數(shù)10%中性甲醛中固定，石蠟包埋，制作5 μm厚眼球石蠟切片，用于免疫組織化學染色，一抗為兔多克隆Sigma-1受體抗體，工作濃度為1∶ 100。參照免疫組織化學檢測試劑盒步驟進行顯色，采用全自動數(shù)字病理切片掃描儀掃描切片并采集、保存圖像。

1.2.4Western blot法檢測視網(wǎng)膜Sigma-1受體蛋白的表達 正常對照組、眼遮蓋14 d組和眼遮蓋11 d組每組各9個標本用于Western blot檢測。取豚鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層標本，稱量后剪碎。按1∶ 10體積比加入細胞裂解液勻漿，4 ℃、9 000×g離心15 min，取上清液，-20 ℃凍存。采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。取蛋白樣品25 μg，一抗為兔多克隆Sigma-1受體抗體，工作濃度為1∶ 500。采用Bandscan5.0圖像分析軟件對目的條帶進行灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算Sigma-1受體蛋白的相對表達量。Sigma-1受體蛋白相對表達量=Sigma-1受體條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.5NE-100給藥方式 NE-100使用時新鮮配制，以生理鹽水為溶劑。參照Jiang等[9]的方法，采用鹽酸奧布卡因滴眼液點眼局部麻醉，采用30G一次性注射器于每天9：00給豚鼠實驗眼球周注射100 μl NE-100，每天1次，連續(xù)14 d。NE-100的注射量分別為6、60和600 μg，以球周注射100 μl生理鹽水作為對照。

1.2.6高效液相色譜電化學法測定神經(jīng)視網(wǎng)膜多巴胺含量 FDM組和FDM+NE-100 60 μg組每組各10個標本用于神經(jīng)視網(wǎng)膜多巴胺含量測定。取豚鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層標本，稱量后液氮保存。色譜條件：Waters uBondapak C18反相色譜柱(150 mm×3.9 mm，5 μm)，流動相為水相(每500 ml含B81.25 g、KH2PO46.8 g、EDTA 18 mg，pH=3.3)，有機相V甲醇∶V水∶V乙腈=78∶ 19∶ 3，流速為0.75 ml/min，工作電壓為0.7 V，進樣量為10 μl。多巴胺的保留時間為6.2 min。計算神經(jīng)視網(wǎng)膜內(nèi)多巴胺質(zhì)量分數(shù)(ng/mg)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料的數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態(tài)分布，以mean±SD表示。采用隨機分組單因素干預多水平研究設(shè)計，各組間豚鼠角膜曲率半徑、眼球屈光度、眼軸長度和視網(wǎng)膜Sigma-1受體蛋白相對表達量總體差異比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。FDM組與FDM+NE-100 60 μg組豚鼠實驗眼視網(wǎng)膜多巴胺質(zhì)量分數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組眼球屈光狀態(tài)的變化

各組間豚鼠屈光度和眼軸長度總體比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=147.81、160.10，均P<0.01)，其中與正常對照組比較，眼遮蓋14 d組和眼遮蓋11 d組豚鼠遮蓋眼相對近視度數(shù)明顯加深，眼軸明顯延長，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；與眼遮蓋14 d組比較，眼遮蓋11 d組相對近視度數(shù)明顯較低，眼軸較短，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。各組間豚鼠角膜曲率半徑總體比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.80，P>0.05)(表1)。

表1 各組豚鼠實驗眼角膜曲率半徑、屈光度及眼軸長度的比較(mean±SD)Table 1 Comparison of corneal curvature radius,diopter and axial length among different groups (mean±SD)組別眼數(shù)角膜曲率半徑(mm)屈光度(D)眼軸長度(mm)正常對照組123.54±0.04+1.54±0.547.94±0.06眼遮蓋14d組123.56±0.05-2.83±0.75a8.37±0.07a眼遮蓋11d組123.55±0.04-1.25±0.58ab8.18±0.04abF值0.80147.81160.10P值>0.05<0.01<0.01 注:與各自正常對照組比較,aP<0.05;與眼遮蓋14d組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) Note:Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the occluded 14-day group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test)

2.2 各組豚鼠實驗眼視網(wǎng)膜Sigma-1受體蛋白表達

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，Sigma-1受體蛋白表達于正常豚鼠的多數(shù)RGCs和光感受器內(nèi)節(jié)以及少量內(nèi)核層細胞，呈淡黃色染色。遮蓋14 d組遮蓋眼視網(wǎng)膜Sigma-1受體蛋白在RGCs及光感受器內(nèi)節(jié)染色明顯增強，內(nèi)核層細胞Sigma-1受體蛋白陽性細胞明顯增多，內(nèi)、外叢狀層均可見Sigma-1受體蛋白陽性表達，柵欄狀排列的Müller細胞染色尤為明顯。與遮蓋14 d組比較，遮蓋11 d組遮蓋眼視網(wǎng)膜Sigma-1受體蛋白在RGCs、光感受器內(nèi)節(jié)陽性染色強度明顯減弱，內(nèi)核層僅存在少量Sigma-1受體蛋白陽性細胞，內(nèi)、外叢狀層及柵欄狀排列的Müller細胞無明顯染色(圖1)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，正常對照組、遮蓋14 d組和遮蓋11 d組豚鼠遮蓋眼中Sigma-1受體蛋白相對表達量分別為0.13±0.04、0.42±0.11和0.17±0.06，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=36.78，P<0.01)，其中遮蓋14 d組遮蓋眼視網(wǎng)膜Sigma-1蛋白相對表達量較正常對照組明顯升高，遮蓋11 d組遮蓋眼視網(wǎng)膜Sigma-1受體蛋白相對表達量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)(圖2)。

圖1 免疫組織化學染色法檢測不同眼遮蓋組豚鼠視網(wǎng)膜中Sigma-1受體蛋白表達(DAB ×400，標尺=20 μm) A：正常對照組豚鼠實驗眼視網(wǎng)膜不同細胞中Sigma-1受體蛋白表達呈淡黃色 B：眼遮蓋14 d組豚鼠實驗眼視網(wǎng)膜中Sigma-1受體蛋白表達細胞增多，染色增強 C：眼遮蓋11 d組豚鼠實驗眼視網(wǎng)膜中Sigma-1受體蛋白表達細胞少于眼遮蓋14 d組，染色強度減弱

圖2 Western blot法檢測不同眼遮蓋組豚鼠視網(wǎng)膜中Sigma-1受體蛋白表達量 A：視網(wǎng)膜中Sigma-1受體蛋白表達電泳圖 眼遮蓋14 d組視網(wǎng)膜中Sigma-1受體蛋白表達條帶強于正常對照組和眼遮蓋11 d組 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶 B：各組視網(wǎng)膜中Sigma-1受體蛋白相對表達量比較 F=36.78，P<0.01.與正常對照組比較，aP<0.01；與眼遮蓋14 d組比較，bP<0.01(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=9) 1：正常對照組；2：眼遮蓋14 d組；3：眼遮蓋11 d組

2.3 不同劑量NE-100干預組眼屈光度變化及視網(wǎng)膜多巴胺質(zhì)量分數(shù)比較

不同NE-100干預組豚鼠實驗眼角膜曲率半徑總體比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.38，P>0.05)；各組豚鼠實驗眼屈光度和眼軸長度總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=27.51、24.04，均P<0.01)。與FDM組比較，F(xiàn)DM+NE-100 6 μg、60 μg和600 μg組實驗眼屈光度絕對值逐漸下降，眼軸長度逐漸縮短，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；FDM+生理鹽水組與FDM組實驗眼屈光度和眼軸長度變化差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)(表2)。FDM組和FDM+NE-100 60 μg組豚鼠實驗眼視網(wǎng)膜中多巴胺質(zhì)量分數(shù)分別為(0.57±0.10)ng/mg和(0.74±0.09)ng/mg，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=15.18，P<0.01)(圖3)。

表2 各組豚鼠實驗眼屈光相關(guān)指標比較(mean±SD)Table 2 Comparison of refractive parameters of guinea pigs among different groups (mean±SD)組別眼數(shù)角膜曲率半徑(mm)屈光度(D)眼軸長度(mm)FDM組103.55±0.04-2.75±0.728.35±0.07FDM+NE-100 6μg組123.54±0.05-1.58±0.76a8.25±0.08aFDM+NE-100 60μg組103.56±0.04-0.35±0.67ab8.12±0.06abFDM+NE-100 600μg組93.54±0.05-0.28±0.57ab8.11±0.05abFDM+生理鹽水組83.56±0.06-2.63±0.698.34±0.08F值0.3827.5124.04P值>0.05<0.01<0.01 注:與FDM組比較,aP<0.05;與FDM+NE-100 6μg組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) FDM:形覺剝奪性近視;NE-100:N,N-二乙基-2-(4-甲氧基-3-苯乙基氧基苯基)乙胺鹽酸鹽 Note:Compared with the FDM group,aP<0.05;compared with the FDM+NE-100 6μg group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) FDM:form dep-rivation myopia;NE-100:N,N-dipropyl-2-[4-methoxy-3-(2-phenylethoxy)-phen-yl]-ethylaminemonohydrochloride

圖3 FDM組與FDM+NE-100 60 μg組豚鼠實驗眼視網(wǎng)膜中多巴胺質(zhì)量分數(shù)比較 與FDM組比較，aP<0.01(獨立樣本t檢驗，n=10) FDM：形覺剝奪性近視；NE-100：N，N-二乙基-2-(4-甲氧基-3-苯乙基氧基苯基)乙胺鹽酸鹽

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，Sigma-1受體在大鼠、小鼠、人、猴等哺乳動物視網(wǎng)膜中分布廣泛，RGCs、光感受器細胞、雙極細胞及Müller細胞等均有表達，尤其是RGCs[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，豚鼠中Sigma-1受體蛋白主要表達在RGCs、光感受器內(nèi)節(jié)細胞及少量內(nèi)核層細胞，F(xiàn)DM引起視網(wǎng)膜中Sigma-1受體蛋白表達量升高，Sigma-1受體蛋白陽性細胞明顯增多，Müller細胞中Sigma-1受體蛋白表達增強更為明顯，豚鼠短期遮蓋后去遮蓋眼近視程度降低，視網(wǎng)膜Sigma-1受體蛋白表達也減弱，接近正常對照眼水平。由此可見，豚鼠FDM形成及恢復過程中視網(wǎng)膜Sigma-1受體蛋白表達發(fā)生相應變化，尤其是內(nèi)核層細胞。以上結(jié)果表明視網(wǎng)膜Sigma-1受體激活在眼罩遮蓋誘導豚鼠FDM形成過程中可能起促進作用。

本研究還通過球周注射Sigma-1受體拮抗劑NE-100驗證視網(wǎng)膜Sigma-1受體蛋白是否能影響豚鼠FDM的形成過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射后可引起遮蓋眼近視度降低、眼軸延長幅度變小，表明NE-100對FDM的形成有抑制作用，但NE-100并不能完全阻止豚鼠FDM的形成，其中60 μg劑量的NE-100對FDM的抑制作用更為明顯。結(jié)合豚鼠FDM形成及恢復過程中視網(wǎng)膜Sigma-1受體蛋白的表達變化，表明視網(wǎng)膜Sigma-1受體拮抗劑在豚鼠FDM形成過程中具有抑制作用。

DAT是位于多巴胺能神經(jīng)元突觸前膜的一種跨膜蛋白，可將多巴胺從細胞外迅速轉(zhuǎn)運到突觸前神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)，維持神經(jīng)元內(nèi)外多巴胺的穩(wěn)態(tài)。無多巴胺結(jié)合時DAT處于向外構(gòu)象，與多巴胺結(jié)合后DAT轉(zhuǎn)變?yōu)橄騼?nèi)構(gòu)象，把多巴胺轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)內(nèi)，再恢復為向外構(gòu)象[10]。Hong等[4]研究發(fā)現(xiàn)，激活的Sigma-1受體能與DAT結(jié)合，促進DAT轉(zhuǎn)變?yōu)橄蛲鈽?gòu)象，加快細胞外多巴胺向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的過程，進而降低視網(wǎng)膜多巴胺含量，促進FDM形成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，球周注射NE-100可引起豚鼠視網(wǎng)膜多巴胺含量升高，表明NE-100對FDM的抑制作用可能與視網(wǎng)膜多巴胺含量的升高有關(guān)。NE-100抑制FDM形成可能與其拮抗視網(wǎng)膜Sigma-1受體，從而減慢DAT轉(zhuǎn)變?yōu)橄蛲鈽?gòu)象，導致細胞外多巴胺向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運減少有關(guān)。此外，視網(wǎng)膜DAT自身也參與FDM的形成，Zhao等[11]用99mTc-TRODAT-1 SPECT DAT顯像技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)豚鼠FDM視網(wǎng)膜DAT數(shù)量減少，這與FDM視網(wǎng)膜多巴胺合成、代謝降低相適應。

多巴胺是視網(wǎng)膜中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與眼球的屈光發(fā)育及近視形成密切相關(guān)。多巴胺的合成源于酪氨酸，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是合成多巴胺的限速酶。新合成的多巴胺被轉(zhuǎn)運至多巴胺能神經(jīng)元的突觸囊泡，光照能刺激其釋放到突觸間隙，作用于突觸前后膜及突觸外的多巴胺受體，完成多巴胺能信號傳遞。DAT又把突觸間隙中的多巴胺轉(zhuǎn)運回細胞內(nèi)，重新進入突觸囊泡或被單胺氧化酶代謝成3，4-二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)。研究表明，視網(wǎng)膜多巴胺是近視的一個抑制信號，豚鼠、雞等FDM的視網(wǎng)膜多巴胺及其代謝產(chǎn)物DOPAC均降低[7,12]，腹腔內(nèi)注射左旋多巴或玻璃體腔內(nèi)注射多巴胺均能有效抑制FDM形成[7,13]。FDM視網(wǎng)膜中多巴胺含量下降與TH降低、多巴胺合成減少有關(guān)[14-16]，此外本研究提示形覺剝奪引起視網(wǎng)膜Sigma-1受體激活也是一個因素，可能與Sigma-1受體激活引起DAT構(gòu)象變化，進而導致細胞外多巴胺向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運加快有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明形覺剝奪能引起豚鼠FDM視網(wǎng)膜Sigma-1受體表達增強，球周注射Sigma-1受體拮抗劑NE-100能抑制FDM形成，且這一作用與其引起視網(wǎng)膜多巴胺含量變化有關(guān)。視網(wǎng)膜Sigma-1受體激活是否通過引起DAT構(gòu)象變化，導致FDM視網(wǎng)膜多巴胺含量下降，仍有待進一步研究加以證實。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突