花葉滇苦菜黃酮對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性研究

宋彥顯，閔玉濤，陳 靜

（鄭州工程技術(shù)學(xué)院，鄭州 450044）

0 引言

花葉滇苦菜（Sonchus asper （L.） Hill）又名續(xù)斷菊，苦馬菜，屬被子植物門，雙子葉植物綱，桔梗目，菊科，苦苣菜屬，在我國被列為一般入侵植物，花葉滇苦菜生長繁殖能力強，在我國分布廣，資源豐富，是深受歡迎的野生蔬菜之一［1］。花葉滇苦菜營養(yǎng)豐富，且具有多種生物活性和藥效。Kamble Sanghmitra S.等［2］研究發(fā)現(xiàn)花葉滇苦菜正己烷提取物具有較好的抗貧血效果。Rahmat Ali Khan，PhD［3］研究發(fā)現(xiàn)花葉滇苦菜提取物可以顯著減輕糖尿病大鼠癥狀，具有降糖活性潛質(zhì)。Mushtaq Muhammad Naveed 等［4］研究發(fā)現(xiàn)花葉滇苦菜水-甲醇提取物有顯著的抗高血壓活性，可以開發(fā)植物降壓藥。陳睿等［5］試驗結(jié)果表明，花葉滇苦菜總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用。

苦苣菜屬植物含有大量的黃酮類物質(zhì)，劉麗敏等［6］研究微波輔助提取苦苣總黃酮得率23.8 mg/g。劉婧等［7］采用超聲波破碎法提取長裂苦苣菜總黃酮提取率可達28.57 mg/g。陳睿等采用微波輻射預(yù)處理提取花葉滇苦菜總黃酮提取率地上部分38.328 mg/g和地下部分7.232 mg/g。近年來，研究發(fā)現(xiàn)苦苣菜屬黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化活性及清除自由基的能力，抗抗?jié)兒蜐冃越Y(jié)腸炎、抗衰老的功效［8-10］。但目前，花葉滇苦菜黃酮抗氧化活性的研究國內(nèi)尚未見報道。

本文以花葉滇苦菜為試驗原材料，用乙醇提取黃酮，經(jīng)乙酸乙酯萃取進行初步純化，采用DPPH自由基清除法測定其抗氧化活性，為花葉滇苦菜資源的綜合利用和天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花葉滇苦菜，采自鄭州市賈魯河附近。

蘆丁（標(biāo)準品，南京奧多福尼生物科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析純，合肥巴斯夫生物科技有限公司）；乙酸乙酯（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；亞硝酸鈉（分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）；硝酸鋁（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800PC DS2型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海山連實驗設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；恒溫水浴鍋（金壇市正基儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準曲線的制備

準確稱取蘆丁標(biāo)準品10 mg，用60%的乙醇溶解后，定容至50 mL的容量瓶中，即得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準儲備液。分別吸取0、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL 于 7個 15 mL的刻度試管中，先加入5%的亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min。再加入10%的硝酸鋁溶液8.0 mL，搖勻后靜置6 min。最后加入4%的氫氧化鈉溶液8.0 mL，搖勻后，加60%的乙醇溶液定容至8 mL，靜置10 min。在510 nm波長處測定其吸光度值，以蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（Abs）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準曲線

1.3.2 花葉滇苦菜黃酮粗提取物的制備

花葉滇苦菜洗凈后，晾干烘烤，粉碎過40目篩，得花葉滇苦菜的粉末。稱取20 g的花葉滇苦菜粉末，用200 mL的80%乙醇，在溫度為80 ℃的條件下回流提取3次，真空泵抽濾2 h，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后，得花葉滇苦菜黃酮乙醇粗提物，測定得率。

1.3.3 花葉滇苦菜黃酮提取物的制備

將花葉滇苦菜黃酮乙醇粗提物加入乙酸乙酯進行萃取，萃取6次以上，合并上清液，50～60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，調(diào)pH值在3～4之間，在用石油醚萃取除色素，蒸發(fā)濃縮后即得花葉滇苦菜黃酮提取物，計算得率。

1.3.4 花葉滇苦菜的黃酮提取率的計算

分別吸取2 mL的萃取前和萃取后的花葉滇苦菜提取物，按照1.3.1方法在510 nm下測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準曲線和回歸方程，計算萃取前和萃取后花葉滇苦菜的黃酮含量，按照下式分別計算提取率。

花葉滇苦菜黃酮提取率（mg/g）=CVn/M

式中 C——樣液經(jīng)吸光度算出的原提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液總體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

M——稱取的花葉滇苦菜質(zhì)量，g。

1.3.5 花葉滇苦菜的黃酮提取液對DPPH自由基清除試驗

采用馬慶一等［11］的研究方法，原花葉滇苦菜黃酮提取液濃度為5.5 mg/mL，分別配制成0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mg/mL 5 種濃度，每個濃度配制5 mL，配制如表1。

取三支試管并依次編號，于試管①中加入2 mL的無水乙醇，和2 mL一定濃度的花葉滇苦菜黃酮提取液，于試管②中加入2 mL的一定濃度花葉滇苦菜黃酮提取溶液和2 mL DPPH溶液，于試管③中加入2 mL的DPPH溶液和2 mL的無水乙醇，分別搖勻后置于25 ℃水浴中保持30 min，以試管①做為調(diào)零管，用分光光度計于517 nm下測定試管②和試管③的吸光度值，分別記為A樣品和A空白。

抑制率計算公式：

抑制率=（A空白-A樣品）/A空白×100%

1.3.6 花葉滇苦菜黃酮提取物、BHT、VC對DPPH自由基清除能力的比較

BHT母液配制：稱取275 mgBHT，用乙醇溶解后定容至50 mL容量瓶中，配制成濃度為5.5 mg/mL的BHT溶液。

Vc母液配制：稱取275 mg的維生素C，用乙醇溶解后，定容至50 mL的容量瓶中，配制成濃度為5.5 mg/mL的維生素C溶液。

將 BHT 和 Vc分別稀釋成 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5mg/mL 6種濃度如表2所示。按照1.2.5的方法檢測其清除DPPH自由基的能力。

表2 BHT和Vc溶液稀釋Table 2 Dilution table of BHT and Vc

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準曲線的制作

在分光光度計波長為510 nm處測定其吸光度以蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（Abs）為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準曲線Fig.1 Rutin standard curve

由圖1可知，回歸方程y=6.366 9x-0.003 1，回歸系數(shù)R2=0.998 5，在蘆丁濃度0～0.15 mg/mL范圍內(nèi)，具有很好的線性關(guān)系。

2.2 花葉滇苦菜黃酮的提取

采用回流-乙醇提取法制備黃酮提取率為11.5%，石油醚脫色、乙酸乙酯萃取后黃酮提取率4.8%，萃取后的黃酮類化合物有所損失，但純度更高。第一次提取過程中使用的95%乙醇，后換成80%的乙醇，提取結(jié)束后，用乙酸乙酯進行萃取，萃取后測定其吸光度值，發(fā)現(xiàn)花葉滇苦菜黃酮提取液顏色對試驗結(jié)果干擾較大，即用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀把乙酸乙酯蒸發(fā)后，用石油醚進行除色處理，除色處理后再次萃取，然后再吸光度值測定，減少誤差。萃取前的黃酮類化合物得率為，萃取后黃酮類化合物提取率為。

植物源黃酮的提取方法多樣，為使得黃酮提取率更高，本文采取回流-乙醇提取法。這是一種比較溫和的提取方法，能夠完整的使黃酮溶解，并能提高它的得率和保護它的生物活性。為進一步測定黃酮得率和研究抗氧化活性奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.3 花葉滇苦菜黃酮提取物對DPPH自由基的清除能力的測定

將花葉滇苦菜黃酮提取物配制成6個濃度，分別測定不同濃度下對DPPH自由基的清除能力，結(jié)果如圖2所示。

圖2 花葉滇苦菜黃酮提取液清除DPPH自由基的能力Fig.2 DPPH radical scavenging ability of flavone extract from Sonchus asper

DPPH自由基即二苯基苦酰肼基自由基，是一種穩(wěn)定的氮中心自由基，常用于體外抗氧化活性的評價［12］。從圖2可知，不同濃度的提取物都具有清除自由基的能力，對DPPH自由基清除能力隨著花葉滇苦菜黃酮提取液濃度增大而增強，且呈上升趨勢，當(dāng)樣品濃度達到1.5 mg/mL時，對DPPH自由基清除能力明顯增強，并開始逐漸趨于平穩(wěn)，測定結(jié)果顯示，當(dāng)濃度為5.5 mg/mL時，樣品對DPPH自由基的抑制率高達94.12%，試驗結(jié)果表明，花葉滇苦菜黃酮類化合物具有很強的抗氧化能力。

2.4 花葉滇苦菜黃酮提取物、BHT、VC對DPPH自由基清除能力的比較

將花葉滇苦菜黃酮提取物、BHT、VC分別配制成6個相同濃度，分別測定不同濃度下對DPPH自由基的清除能力如圖3所示。

圖3 花葉滇苦菜黃酮提取液、BHT、Vc對DPPH自由基清除能力的比較Fig.3 Comparison of DPPH free radical scavenging ability of flavone extract of Sonchus asper，BHT and Vc

BHT是一種人工合成抗氧化劑，且是一種油溶性抗氧化劑，這里為了做單因素對照試驗，所以溶劑選用了無水乙醇。從結(jié)果可以看出，抗氧化活性不如花葉滇苦菜黃酮類化合物高。在5.5 mg/mL時，BHT對DPPH自由基的抑制率達80.10%。

Vc是具有強抗氧化活性的抗氧化劑，常作抗氧化研究的對照品［13］。從圖3可以看出，Vc的抗氧化活性很強，當(dāng)Vc溶液的濃度達到0.5 mg/mL時，對DPPH自由基抑制率高達到97.05%，隨著Vc的濃度增大，對DPPH自由基清除能力明顯增強，在5.5 mg/mL時Vc對DPPH自由基的抑制率高達98.75%。說明Vc的抗氧化活性很強。

比較可知，花葉滇苦菜提取液黃酮的濃度與DPPH自由基清除能力呈正相關(guān)。經(jīng)過不同濃度梯度稀釋，花葉滇苦菜黃酮提取物，BHT，Vc對DPPH自由基有不同的清除能力?；ㄈ~滇苦菜黃酮提取物對DPPH自由基的清除能力非常強，這也證明，花葉滇苦菜中含有大量的黃酮類化合物，且濃度越高，抑制率越高，若進一步純化，提高其純度，其對DPPH自由基的清除能力有望超越Vc。

3 結(jié)論

（1）采用乙醇提取法，80%乙醇，80 ℃抽提，乙酸乙酯萃取，萃取前的黃酮類化合物得率為11.5%，萃取后黃酮類化合物提取率為4.8%。試驗結(jié)果表示，萃取后的黃酮類化合物有所損失，但純度更高。

（2）花葉滇苦菜中的黃酮提取液濃度為5.5 mg/mL時，對DPPH自由基抑制率達94.12%，隨著花葉滇苦菜黃酮提取液的濃度越高，抗氧化活性也越強。

（3）花葉滇苦菜中的黃酮提取液、BHT和Vc在5.5 mg/mL時，對DPPH自由基的抑制率分別為94.12%、80.10%和 98.75%，相同濃度下花葉滇苦菜黃酮提取液對DPPH自由基的抑制率遠遠大于BHT，接近Vc?；ㄈ~滇苦菜黃酮有非常強的抗氧化作用，可為花葉滇苦菜資源的綜合利用和天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考和理論支撐。

4 展望

黃酮類化合物安全無毒，又因其具有較強的抗氧化活性及藥理活性，近年來黃酮類化合物在醫(yī)療、食品、化妝品等領(lǐng)域逐漸得到廣泛的應(yīng)用。花葉滇苦菜中有大量黃酮類物質(zhì)，經(jīng)本次研究發(fā)現(xiàn)花葉滇苦菜黃酮有很好的抗氧化性能。后續(xù)可以通過大孔樹脂、聚酰胺及葡聚糖凝膠柱層析等對花葉滇苦菜黃酮進一步純化，研究純化后黃酮的抗氧化活性。還可以將純化后的黃酮添加到食品及護膚品中，進行應(yīng)用研究，為花葉滇苦菜黃酮的開發(fā)利用提供進一步的理論依據(jù)。