益生菌對(duì)脂多糖誘發(fā)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥及認(rèn)知功能障礙保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

李正民，李江靜，莊瑩瑩，閆 輝，劉偉娜，屈麗虹

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710038)

神經(jīng)退行性變目前已成為我國(guó)老年人群中主要的致殘致死原因之一，包括阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病等在內(nèi)的疾病，由于其發(fā)病機(jī)制不明，目前尚無治愈這些疾病的藥物，因此神經(jīng)退行性病的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)之一。已有研究證實(shí)神經(jīng)退行性變其本質(zhì)是神經(jīng)慢性炎癥，從炎癥入手或許是可以解開神經(jīng)退行性病的一把鑰匙。AD俗稱老年性癡呆或認(rèn)知障礙，是老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。在動(dòng)物模型中的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)注射到大腦的第四腦室中，可以重現(xiàn)AD中的許多炎癥和病理特征[2]，而且又有研究表明腹腔注射LPS可引起小鼠海馬區(qū)域淀粉樣β蛋白沉積進(jìn)而導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能障礙[3]，因此腹腔注射LPS可模擬AD樣病理改變，是一種可用于研究AD相關(guān)的神經(jīng)炎癥和隨后神經(jīng)功能障礙合適的動(dòng)物模型[4-5]。

近年來，越來越多的研究表明，人類共生微生物是影響宿主健康的重要環(huán)境因素。大約95%的共生微生物位于腸道，它們?cè)谌祟悹I(yíng)養(yǎng)、消化、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、炎癥、生長(zhǎng)、免疫和抵御病原體感染方面發(fā)揮著重要作用[3]。在眾多的腸道微生物中，乳酸菌、雙歧桿菌和腸球菌已被證明可以通過改善腸道微生物平衡而對(duì)宿主產(chǎn)生有益的影響，因此被歸類為益生菌[4]。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射LPS模擬神經(jīng)炎癥[4-5]，利用口服益生菌的干預(yù)方式，觀察益生菌是否對(duì)LPS所致的認(rèn)知障礙起保護(hù)作用，是否會(huì)減輕神經(jīng)炎癥的產(chǎn)生，為神經(jīng)炎癥以及神經(jīng)退行性病變的防治研究提供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雄性SD大鼠共32只，體重220～250 g，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，自由飲食，12 h明暗循環(huán)。

1.1.2 主要儀器與試劑：水迷宮視頻分析系統(tǒng)WMT-1005(成都泰盟)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、一氧化氮合酶(iNOS)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。益生菌(LACTIBIANE,Store Houses,B.V.)，脂多糖(Sigma)，兔抗BDNF單克隆抗體(Abcam)，小鼠抗GAPDH單克隆抗體(Abcam)，GE9612T-S基因擴(kuò)增儀(杭州柏恒科技有限公司)，Line Gene 9640 熒光定量 PCR 儀(杭州博日科技有限公司)?？俁NA 抽提純化試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，Real Time PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)， 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)試劑盒(TAKARA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃头纸M：將大鼠隨機(jī)分為四組，每組8只。對(duì)照組：大鼠灌胃2 ml生理鹽水，連續(xù)3周。LPS組：大鼠灌胃2 ml生理鹽水連續(xù)3周，自第3周開始，生理鹽水灌胃處理后腹腔注射LPS，劑量為250 μg/(kg·d)，連續(xù)1周。LPS+益生菌組：將乳酸桿菌(Lactobacillus)溶于生理鹽水中，制備成濃度為5×107CFU/ml 的益生菌懸液，取2 ml益生菌懸液灌胃，即108CFU/d，連續(xù)3周灌胃給藥，自第3周開始益生菌懸液灌胃處理后腹腔注射LPS，劑量為250 μg/(kg·d)，連續(xù)1周。益生菌組：取2 ml益生菌懸液灌胃，即108CFU/d，連續(xù)3周灌胃給藥，觀察該益生菌懸液對(duì)健康成年大鼠神經(jīng)系統(tǒng)及認(rèn)知功能是否有影響。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法：開始LPS腹腔注射的第2天即開始水迷宮學(xué)習(xí)行為訓(xùn)練。水迷宮采用直徑為1.5 m、高為0.5 m的圓形的黑色水池，并且在水池壁內(nèi)測(cè)貼有不同顏色、不同形狀的圖案作為標(biāo)志。開始訓(xùn)練時(shí)，在池中加入黑色墨水，使水不透明，水溫保持(25±1)℃。調(diào)節(jié)合適的實(shí)驗(yàn)室亮度，保持實(shí)驗(yàn)室周圍環(huán)境安靜舒適。在某一象限內(nèi)放置一個(gè)直徑約為10 cm的有機(jī)玻璃平臺(tái)，置于水面下約1 cm。水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段，即訓(xùn)練學(xué)習(xí)階段和測(cè)試階段。訓(xùn)練學(xué)習(xí)階段為期5 d，每天將每組大鼠(n=8)從四個(gè)象限設(shè)定好的位置分別放入水中，直到大鼠找到水下的平臺(tái)，并在平臺(tái)上保持停留15 s，如果大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)員應(yīng)將其引導(dǎo)至平臺(tái)上并停留15 s。行為學(xué)訓(xùn)練后第6天為測(cè)試階段，移去水下的平臺(tái)，觀察大鼠60 s內(nèi)通過平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)及首次達(dá)臺(tái)時(shí)間。所有實(shí)驗(yàn)都通過攝像頭錄像，并通過電腦圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA):接受行為學(xué)測(cè)試后的大鼠立即麻醉，斷頭，取出大腦組織，并分離出大腦皮層組織，立即置于液氮速凍后放于-80 ℃冰箱保存。之后取出冷凍大腦皮層組織，在低溫環(huán)境下進(jìn)行組織勻漿，離心后取上清液，用ELISA試劑盒測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的水平。先制備標(biāo)準(zhǔn)品(倍比稀釋，濃度參照說明書)，隨后按序依次加樣，設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、待測(cè)樣品孔，100 μl/孔，輕晃混勻，37 ℃孵育90 min，之后加入生物素化抗體工作液(1∶100)，100 μl/孔，37 ℃孵育60 min，洗板3次，加入酶結(jié)合物工作液(1∶100)，100 μl/孔，37 ℃孵育30 min，洗板5次，加入底物溶液，90 μl/孔，37 ℃避光孵育15 min左右，加入終止液50 μl/孔，570 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值，計(jì)算濃度。

1.2.4 蛋白免疫印跡(Western blot):從-80 ℃冰箱取出已經(jīng)冷凍的皮層額葉組織低溫下勻漿提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，沸水煮10 min待用。各組取樣品30 μg，以樣品中的GAPDH作為內(nèi)參，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，然后用5%脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h，根據(jù)各蛋白分子量不同，將膜剪裁開，分別放入按比例配制好的一抗中(兔抗BDNF單克隆抗體，小鼠抗GAPDH單克隆抗體)，置于4 ℃冰箱中孵育過夜。TBST洗膜5次，每次5 min，分別放入對(duì)應(yīng)二抗中，室溫孵育1 h。洗膜5次，每次5 min，之后化學(xué)發(fā)光發(fā)熒光顯色。

1.2.5 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) :將動(dòng)物注射麻醉后,處死,取出腦組織,剪碎浸入5～10倍體積的RNA GUARD液中并置入4 ℃冰箱過夜后移入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。注意此步驟動(dòng)作一定要非常迅速,以盡可能避免組織中的降解。按照步驟依次提取組織總RNA，合成cDNA第一鏈及進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：將反應(yīng)體系混勻后短暫離心混勻，反應(yīng)液于94 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；完成40個(gè)循環(huán)后72 ℃充分延伸5 min。委托上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)與合成引物：腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)-F(bp577):5’-CTGGAGAAACTCCCGGTATC-3’,BDNF-R(bp711c):5’-GGTAGTTCGGCATTGCGAGT-3’。

2 結(jié) 果

2.1 各組LPS導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙比較 在水迷宮定位航行試驗(yàn)中訓(xùn)練第1天時(shí)，LPS組大鼠潛伏期長(zhǎng)于對(duì)照組大鼠，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠在水迷宮訓(xùn)練至第5天時(shí)，LPS+益生菌組大鼠潛伏期短于LPS組大鼠，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1A)。水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，LPS組大鼠首次達(dá)臺(tái)時(shí)間延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而LPS+益生菌組大鼠與LPS組大鼠相比，LPS+益生菌組大鼠首次達(dá)臺(tái)時(shí)間縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

A:各實(shí)驗(yàn)組大鼠水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中訓(xùn)練潛伏期統(tǒng)計(jì)結(jié)果；B:各實(shí)驗(yàn)組大鼠水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中首次達(dá)臺(tái)時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 各組大鼠大腦皮層組織促炎因子水平比較 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，LPS組大鼠大腦皮層組織TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而LPS+益生菌組與LPS組相比，TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表1(圖2)。

表1 各組大鼠大腦皮層組織促炎因子水平比較

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05；與LPS組相比，*P<0.05

2.3 各組大鼠大腦皮層BDNF表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，LPS組大鼠大腦皮層組織BDNF表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而LPS+益生菌組與LPS組相比，BDNF表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；qt-PCR結(jié)果與Western blot結(jié)果一致,見表2(圖3)。

表2 各組大鼠大腦皮層BDNF表達(dá)水平比較

A:大鼠大腦皮層對(duì)BDNF的表達(dá)Western blot及統(tǒng)計(jì)結(jié)果；B:大鼠大腦皮層對(duì)BDNF的qt-PCR結(jié)果統(tǒng)計(jì)。與對(duì)照組相比,#P<0.05；與LPS組相比,*P<0.05

3 討 論

本研究聚焦于益生菌對(duì)LPS所致大鼠神經(jīng)炎癥及認(rèn)知功能的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射LPS導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙，而益生菌可以改善LPS所致的大鼠認(rèn)知功能障礙，提高其空間學(xué)習(xí)記憶能力，并且降低LPS所致大鼠大腦皮層組織TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的表達(dá)，升高BDNF的表達(dá)，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)[6-7]。

有證據(jù)表明腸道微生物群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)之間存在雙向聯(lián)系，存在腸-腦軸[8]。事實(shí)上，腸道菌群組成的改變可能在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[9]。在這一方面，益生菌的使用是一個(gè)有趣、可行的方法平衡腸道菌群的組成，從而對(duì)宿主健康產(chǎn)生有益的影響[10]。大量研究表明，含益生菌的口服細(xì)菌療法對(duì)各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有多種益處。近期，也有報(bào)道稱益生菌補(bǔ)充乳酸菌和雙歧桿菌通過抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用對(duì)神經(jīng)退行性疾病有積極的影響[11]。已有研究表明，LPS可激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中toll樣受體4 (TLR4)信號(hào)，該信號(hào)與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和各種神經(jīng)炎癥介質(zhì)的激活有關(guān)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[12]。神經(jīng)炎癥與認(rèn)知障礙和記憶衰退有關(guān)，因?yàn)樵谘装Y期間，海馬體更容易在突觸傳遞和可塑性方面發(fā)生變化[13]。已有研究結(jié)果證實(shí)了益生菌的有益作用，增強(qiáng)腸上皮完整性，保護(hù)屏障不受破壞，減少促炎反應(yīng)，抑制神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性的起始或增殖。例如,它已被證明無論在體外還是在大腦中，腸球菌都有效，乳桿菌減少TNF-α生產(chǎn)和補(bǔ)充這些益生菌菌株在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中減少氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)抗氧化酶的產(chǎn)生[14]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

BDNF是表達(dá)最廣泛、研究最密切的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一，在結(jié)構(gòu)上與神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4相關(guān)，調(diào)節(jié)特定神經(jīng)元群體的生存能力和功能完整性[15]。BDNF參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的多種功能，包括神經(jīng)元存活和分化[16]，而BDNF水平的變化可能通過突觸傳遞功能障礙和可塑性導(dǎo)致認(rèn)知缺陷，導(dǎo)致精神分裂癥相關(guān)的化學(xué)和結(jié)構(gòu)失衡[17]。與對(duì)照組相比，小鼠海馬特異性缺失BDNF會(huì)導(dǎo)致新的物體識(shí)別和空間學(xué)習(xí)障礙[18]。在水迷宮中測(cè)試時(shí)，發(fā)現(xiàn)BDNF基因單拷貝缺失小鼠的學(xué)習(xí)能力明顯受損，需要的訓(xùn)練時(shí)間是野生型小鼠的兩倍。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)下降，而口服益生菌可增加BDNF的表達(dá)。而已經(jīng)有學(xué)者認(rèn)為益生元和益生菌作為認(rèn)知障礙的潛在治療方法[19]，因?yàn)槟c道微生物群可以通過改變神經(jīng)遞質(zhì)的功能來調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的BDNF功能，比如通過影響kynurenine通路等調(diào)節(jié)機(jī)制，或者通過改變大腦中的短鏈脂肪酸(SCFAs)的可用性和作用[15]。

有學(xué)者提出飲食干預(yù)是改變腸道菌群最有效的方法之一[20]，基于我們的研究結(jié)果，益生菌因其有效的抑炎作用可以作為神經(jīng)炎癥及神經(jīng)退行性疾病的防治方法之一，并且其抑炎作用確實(shí)改善了LPS引起的認(rèn)知功能障礙。綜上所述，益生菌可以通過抑制炎癥反應(yīng)而對(duì)LPS誘發(fā)大鼠認(rèn)知功能障礙起到保護(hù)作用。這一結(jié)論為益生菌對(duì)神經(jīng)炎癥的防治提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步探索益生菌抑炎作用提供了方向。