Box-Behnken響應面法優(yōu)化瑪卡多糖提取工藝

黃貽杰，張海珠

（大理大學藥學與化學學院，云南 大理 671000）

瑪卡（Lepidium meyeniiWalp.），為十字花科植物，原產(chǎn)于南美洲印第安山脈，藥食兩用，有“南美人參”之譽［1，2］，具有改善性功能、抗疲勞、增強免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、改善記憶、降血糖、抗病毒、提高生殖細胞質(zhì)量與活力等作用［3-6］?，斂ǘ嗵鞘乾斂ǖ闹饕钚猿煞郑嘘P瑪卡多糖的研究報道較少［7，8］。

瑪卡多糖的提取方法有超聲提取和加熱回流提取。已有報道加熱回流提取不如超聲提取效率高，且超聲提取操作簡單、方便、快速、適合工業(yè)化生產(chǎn)［9］。本研究采用響應面設計分析，確定瑪卡多糖的最佳提取工藝，以期為瑪卡多糖的開發(fā)利用和質(zhì)量標準提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

瑪卡樣品于2020年采收期采自云南省某種植基地；葡萄糖對照品（天津市福晨化學試劑廠批號20180411）；硫酸、苯酚、乙醇等試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

2500C型多功能粉碎機（永康市金穗機械制造廠）、SB-25-12DT型超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、HH-S2S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海暉創(chuàng)化學儀器有限公司）、AX224ZH/E型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）、UV-9000S型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 樣品打粉，過40目篩，取300.00 g瑪咖粉末于圓底燒瓶，加入適量的75%乙醇溶液，加熱回流2 h，棄提取液，除去脂溶性成分，殘渣揮干溶劑后備用。

1.2.2 提取 精密稱取樣品粉末2.00 g于三角燒瓶中，加入一定量的去離子水，進行超聲提取并抽濾，濾液定容待用。

1.2.3 標準曲線繪制 參考文獻［10］，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。同時方程為：A=28.94C+0.07，相關系數(shù)r=0.993，在0.004 7～0.026 8 mg/mL線性良好。

1.2.4 瑪卡多糖含量測定 取適量提取液，以苯酚-硫酸法測定吸光度代入標準曲線方程中，得其多糖的質(zhì)量濃度。

1.2.5 單因素試驗 稱取瑪咖粉末2.00 g，考察超聲時間（20、30、40、50、60 min）、液料比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）、溫度（30、40、50、60、70℃）對瑪咖多糖提取率的影響。

1.2.6 響應面設計 考察超聲時間、液料比、溫度3個因素作為響應因變量，利用Design-expert 8.0.6軟件，按照Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以瑪咖提取液中多糖得率為響應值，通過響應面曲面分析進行試驗條件的優(yōu)化，響應面設計因素與水平如表1所示。

表1 響應面設計因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲時間對多糖得率的影響 當液料比為40∶1、溫度為60℃，超聲時間在20～30 min內(nèi)，多糖得率呈上升趨勢，然后隨時間的延長有所下降（圖1）。因此，選擇30 min為較佳超聲時間。

圖1 超聲時間對多糖提取的影響

2.1.2 料液比對多糖得率的影響 當超聲時間為30 min、溫度為60℃，液料比在20∶1～40∶1時，多糖得率逐漸升高，而后多糖得率有所下降（圖2）。因此，選擇40∶1為較佳提取液料比。

圖2 液料比對多糖提取的影響

2.1.3 溫度對多糖得率的影響 當超聲時間為30min、液料比為40∶1，溫度在30～60℃時，多糖得率逐升高，而后隨溫度的繼續(xù)升高，多糖提取率下降（圖3）。因此，60℃為較佳提取溫度。

圖3 溫度對多糖提取的影響

2.2 響應面設計結(jié)果

Box-Behnken響應面試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。經(jīng)過Design-expert 8.0.6軟件多元回歸擬合，得到瑪卡多糖的預測模型方程：Y=39.32+2.63A+2.78B+10.21C-0.26AB+1.23AC-0.54BC-2.48A2-4.30B2+1.23C2，其中，Y為瑪卡多糖含量，A為超聲時間，B為液料比，C為溫度。

表2 Box-Behnken效應面試驗因素水平及結(jié)果

從表3可以看出，溫度的“Prob＞F”值小于0.01，表明其對瑪卡多糖得率的影響極顯著，液料比和超聲時間的“Prob＞F”值小于0.05，表明其影響顯著，整體模型的“Prob＞F”值小于0.01，表明該二次方程模型高度顯著。

表3 回歸方程方差分析回歸方程方差分析

失擬項F為2.51，P為0.192（P＞0.05），表明方程模型誤差較??；決定系數(shù)為0.956 5，表明其因變量與全體自變量之間的多元回歸關系顯著，回歸方程對試驗擬合情況較好，可用該回歸方程對不同提取條件下瑪卡多糖得率進行預測。

響應面圖形是響應值對各因素（A、B、C）所構(gòu)成的三維空間曲面圖，從圖4至圖6可看出，各因素交互作用對響應值的影響，溫度的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，溫度的最佳值在60℃；而超聲時間和液料比次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，其最佳響應值分別為40 min和40∶1。

圖4 提取時間和液料比對多糖得率的響應面和等高線

圖5 提取時間和溫度對多糖得率的響應面和等高線

圖6 液料比和溫度對多糖得率的響應面和等高線

3 小結(jié)

本試驗以超聲時間、液料比、溫度為考察因素，采用Box-Behnken響應面法，建立了瑪卡多糖提取的二次多項式數(shù)學模型，經(jīng)顯著性檢驗分析，可利用該模型預測瑪卡多糖的得率。利用優(yōu)化后的最佳工藝為超聲時間40 min、液料比40∶1、溫度60℃，在此工藝下多糖得率為51.21%，該法為瑪卡多糖的進一步開發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。