小柄馬勃液體發(fā)酵產(chǎn)物對大鼠四氯化碳型肝損傷的治療作用*

步洪石，楊秀璐，王淑敏

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

肝損傷是由物理、化學(xué)、病毒感染以及自身免疫疾病等多種因素導(dǎo)致的肝臟器質(zhì)性損害，如不及時(shí)治療還會引起肝硬化、肝纖維化或者肝癌等[1]。目前肝損傷的治療手段主要集中于抗氧化或減緩炎癥反應(yīng)等方面[1－4]，而傳統(tǒng)的中草藥或膳食補(bǔ)劑恰恰是藥物性肝損傷的主要成因[5]，治療效果與肝毒副作用處于并存的兩難境地，尋找具有確切養(yǎng)肝功效、減緩肝損傷進(jìn)程的活性物質(zhì)十分必要。

小柄馬勃（Lycoperdon pedicellatus） 是馬勃科（Lvcoperdaceae）、馬勃屬 （Lycoperdon Tourn．ex Pers．）的一種藥用真菌，其子實(shí)體具有止血、抗?jié)?、抗炎等諸多藥理作用[6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小柄馬勃發(fā)酵物可以改善香煙誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺病小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，顯著抑制炎癥因子的生成[7]，具有良好的抗炎及抗氧化作用。故擬采用小柄馬勃發(fā)酵產(chǎn)物探究其對四氯化碳導(dǎo)致肝損傷模型的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為相關(guān)疾病治療藥物的開發(fā)提供一定的試驗(yàn)依據(jù)與理論參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)藥品與試劑

水飛薊賓（批號：181114），鄭州荔諾生物科技有限公司；生理鹽水，上海現(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司；乙醇，北京化工廠；小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲與發(fā)酵液，由長春中醫(yī)藥大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室自制；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、腫瘤壞死因子－α （tumor necrosis factor－α，TNF－α）、白細(xì)胞介素－1β （interleukin－1β，IL－1β）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、透明質(zhì)酸 （hyaluronic acid，HA） 試劑盒（批號：E20171201A），上海源葉生物科技有限公司；歐麗薇蘭橄欖油，嘉里糧油（天津）有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性封閉群（sprague－dawley，SD） 大鼠63只 （180 g～210 g），無特定病原體 SPF（specific pathogen free，SPF） 級別，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供。動(dòng)物合格證號：SCXK（遼）2015－0001；合格證編號：NO．211002300024233。

1.3 試驗(yàn)儀器

ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀，西門子公司；FA25組織勻漿機(jī)，上海福魯克流體機(jī)械制造有限公司；Rayto RT－6000酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；Olympus生物顯微鏡，上海普赫光電科技有限公司；TGL16M臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；AUY220萬分之一分析天平，島津國際貿(mào)易上海有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 給藥與分組

將63只SD大鼠，隨機(jī)分為7組。分別是：空白組（不造模，灌胃生理鹽水）；模型組（造模，灌胃生理鹽水）；陽性藥組（造模，灌胃水飛薊賓41．1 mg·kg－1，1 次/d）；小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲醇提組（灌胃，低劑量 1 g·kg－1、高劑量 2 g·kg－1，1 次/d）；小柄馬勃發(fā)酵液組（灌胃，低劑量1 g·kg－1、高劑量2 g·kg－1，1 次/d）。

2.2 造模方法

通過磁力攪拌器將比例為1∶1的橄欖油與四氯化碳（3 mg·mL－1）均勻混合，每周皮下注射2次，連續(xù)給藥8周（第6周檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)，觀察造模是否成功），確定造模成功，各治療組分別給予相應(yīng)治療藥物，每日1次，至第8周末。末次給藥禁食、不禁水10 h，采用10%水合氯醛0．3 mL·kg－1進(jìn)行動(dòng)物麻醉，腹主動(dòng)脈取血、取肝臟，血液靜置 90 min 以上，3 500 r·min－1、4℃離心 10 min，移液槍吸取上清液置于1．5 mL EP管中備用，按照相應(yīng)試劑盒說明檢測AST、ALT、IL－1β、TNF－α、HA含量；肝組織稱重，加入9倍量生理鹽水，充分勻漿后，同樣 3 500 r·min－1、4℃離心 10 min，移液槍吸取上清液置于1．5 mL EP管中4℃冷藏，按照相應(yīng)試劑盒說明檢測SOD、MDA指標(biāo)。

2.3 肝組織病理學(xué)檢驗(yàn)

分離部分肝臟，置于50 mL EP管中，以4%多聚甲醛充分固定，制備石蠟切片，蘇木精－伊紅（hematoxylin－eosin staining，H．E） 染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果分析

3.1 血清中ALT、AST含量檢測結(jié)果

小柄馬勃對血清中ALT、AST含量的影響見表1。

表1 小柄馬勃對血清中ALT、AST含量的影響Tab．1 The effect of Lycoperdon pedicellatus on the content of ALT and AST in serum

由表1顯示，模型組較空白組ALT、AST含量顯著升高，具有極顯著差異（P<0．001），證明造模成功。陽性藥組、小柄馬勃治療組較模型組ALT、AST 含量顯著降低 （P<0．05、P<0．001），小柄馬勃醇提高劑量組對于AST的降低效果最佳，發(fā)酵液高劑量組對于ALT的降低效果最佳。

3.2 血清中IL-1β、TNF-α含量檢測結(jié)果

小柄馬勃對血清中IL－1β、TNF－α含量的影響見表2。

表2 小柄馬勃對血清中IL－1β、TNF－α含量的影響Tab．2 The effect of Lycoperdon pedicellatus on the content of IL－1β and TNF－α in serum

如表2所示，模型組與空白組比較IL－1β含量顯著升高（P<0．001），TNF－α含量極顯著升高（P<0．001），證明此造模方法能夠?qū)е麓笫篌w內(nèi)炎癥因子的升高，造成炎癥反應(yīng)。與陽性藥組相比，小柄馬勃發(fā)酵物對于IL－1β含量降低效果不明顯。所有治療組對降低TNF－α含量均有較好效果，且小柄馬勃發(fā)酵產(chǎn)物各組的效果優(yōu)于陽性藥組，菌絲醇提高劑量組對于TNF－α的降低效果最佳。

3.3 血清中SOD、MDA及HA含量檢測結(jié)果

小柄馬勃對血清中SOD、MDA及HA含量的影響見表3。

如表3所示，模型組與空白組相比SOD含量顯著降低（P<0．05），MDA及HA含量顯著升高（P<0．05），證明此造模方法能夠?qū)е麓笫螽a(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。除小柄馬勃發(fā)酵液低劑量組外，其余各治療組均能顯著升高肝組織中的SOD水平（P<0．05）。此外，各治療組均能顯著降低肝組織中MDA含量（P<0．001）。小柄馬勃醇提低劑量、高劑量組與小柄馬勃發(fā)酵液低劑量組均能顯著降低HA水平（P<0．001）。

表3 小柄馬勃對血清中SOD、MDA及HA含量的影響Tab．3 Effect of Lycoperdon pedicellatus on the content of SOD,MDA and HA in serum

3.4 肝組織病理學(xué)檢驗(yàn)

肝損傷大鼠肝臟的光學(xué)顯微鏡鏡檢結(jié)果見圖1。

由圖1顯示，空白組鏡下可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列。模型組肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞普遍變性，可見廣泛的脂肪變性并有散在的嗜酸性變。治療組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，肝細(xì)胞索排列規(guī)則，與空白組相較，各組均有不同程度肝細(xì)胞脂肪變性，細(xì)胞輕度增生，與模型組比較，脂肪變性不明顯。

圖1 小柄馬勃對肝損傷大鼠肝臟的病理影響（H.E，100×）Fig.1 Pathological effects of Lycoperdon pedicellatus on liver in rats with liver injury(H.E,100×)

4 討論

目前試驗(yàn)性肝損傷模型主要包括化學(xué)性肝損傷、免疫性肝損傷和酒精性肝損傷，四氯化碳因其自身的溶酶作用和自由基代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生可以導(dǎo)致化學(xué)性肝損傷，故研究選擇了四氯化碳誘導(dǎo)化學(xué)性肝損傷經(jīng)典動(dòng)物模型[8]，以相應(yīng)炎癥因子及自由基評測指標(biāo) （ALT、AST、TNF－α、IL－1β、MDA、HA、SOD）的變化作為造?；蛑委熜Ч暮饬繕?biāo)準(zhǔn)。ALT廣泛存在于肝細(xì)胞中，一般與AST同時(shí)作為診斷肝臟疾病的重要參照，AST/ALT>1時(shí)，提示肝臟出現(xiàn)了實(shí)質(zhì)性的損害，是急性肝細(xì)胞損害的敏感標(biāo)志[9]。結(jié)果顯示，模型組較空白組ALT、AST、TNF-α、IL-1β、MDA、HA含量顯著增高，SOD含量顯著降低，病理結(jié)果顯示肝小葉結(jié)構(gòu)異常，肝臟細(xì)胞變性等，說明化學(xué)性肝損傷模型建立成功，而小柄馬勃治療組可以不同程度地降低ALT、AST、TNF-α、MDA、HA的含量，升高SOD的含量，恢復(fù)細(xì)胞正常形態(tài)與功能，發(fā)揮肝損傷的治療功效。

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，其產(chǎn)生能夠加劇膜脂損傷，因此可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以及細(xì)胞的損傷程度[10]；SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，可抵抗氧自由基對細(xì)胞造成的損害，同MDA一樣，是評價(jià)肝損傷程度的關(guān)鍵指標(biāo)[11]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組與空白組相比SOD含量顯著降低，而MDA含量顯著升高，說明大鼠體內(nèi)發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組相比，小柄馬勃發(fā)酵產(chǎn)物能夠顯著降低大鼠體內(nèi)MDA含量，小柄馬勃發(fā)酵液低劑量組能顯著提高SOD含量，其他各治療組SOD皆有不同程度上升趨勢，說明小柄馬勃能夠調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而起到保護(hù)肝臟的作用。

由結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，該造模方法能夠使大鼠體內(nèi)IL-1β、TNF-α等促炎癥因子含量顯著性升高，說明此造模方法誘發(fā)了炎癥反應(yīng)，而小柄馬勃發(fā)酵物組雖然并未顯著降低IL-1β含量，但均能顯著下調(diào)TNF-α含量，證明小柄馬勃發(fā)酵物具有調(diào)節(jié)肝臟炎癥反應(yīng)的作用。HA由間質(zhì)細(xì)胞合成，經(jīng)淋巴系統(tǒng)分泌入血，HA的含量作為反映肝內(nèi)皮細(xì)胞功能和肝纖維化進(jìn)程的標(biāo)志，其升高幅度與肝纖維化呈正相關(guān)[12]。與空白組相較，模型組HA含量顯著升高，而相較模型組，小柄馬勃治療組能夠顯著下調(diào)HA含量，提升細(xì)胞的HA代謝能力，發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞，緩解肝纖維化的作用。此外，由病理切片所顯示的結(jié)果來看，四氯化碳能夠誘發(fā)嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷與脂肪變性，而小柄馬勃發(fā)酵物治療組能夠減少肝細(xì)胞的損傷，維持肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，發(fā)揮預(yù)防和治療肝損傷類疾病的作用。

綜上所述，小柄馬勃能夠通過降低大鼠血清中ALT及AST的含量，調(diào)節(jié)肝組織中自由基含量與脂質(zhì)過氧化程度，降低炎癥反應(yīng)，減緩肝細(xì)胞纖維化進(jìn)程來維持肝臟正常的生理機(jī)能。目前肝臟類疾病以其較高的發(fā)病率與致死率成為醫(yī)藥學(xué)界亟待解決的關(guān)鍵問題，人群中肝炎、肝硬化、酒精肝、肝癌的患者比率逐年升高，小柄馬勃預(yù)防和治療肝損傷類疾病的研究對維持人類健康水平具有參考價(jià)值。