重鉻酸鉀染毒對(duì)大鼠子一代肺毒性作用

吳倩 劉增澤 劉燕群 林可欣 管慶美 魯雄兵 張龍 諶宗堯 劉盈輝

江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430056

鉻在人類生活中廣泛存在，分為自然來(lái)源和人類活動(dòng)產(chǎn)生兩種，自然來(lái)源包括巖石、水、大氣及土壤等自然環(huán)境中存在的鉻，人類工業(yè)生產(chǎn)也會(huì)產(chǎn)生大量鉻［1］。鉻大多數(shù)以六價(jià)及三價(jià)形態(tài)存在，三價(jià)形態(tài)鉻不具有毒性，六價(jià)形態(tài)鉻具有毒性。皮革和電鍍行業(yè)的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的六價(jià)鉻，廢水和廢渣處理不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致六價(jià)鉻滲透入耕地，經(jīng)過(guò)蓄積作用被農(nóng)作物吸收；此外，廢水亂排放可能會(huì)導(dǎo)致六價(jià)鉻污染飲用水，人類食入污染的作物或飲用水會(huì)造成六價(jià)鉻在人體內(nèi)蓄積，從而損傷機(jī)體。研究顯示，六價(jià)鉻可通過(guò)接觸人體皮膚和呼吸道途徑進(jìn)入人體，造成基因毒性、染色體畸變以及致癌等嚴(yán)重危害，長(zhǎng)期從事金屬冶煉工作的工人會(huì)出現(xiàn)鼻出血、鼻中隔穿孔、呼吸道癌及肺癌等疾病［2-3］。既往研究顯示，六價(jià)鉻可在鼠體內(nèi)蓄積，并具有毒性作用［4］，且六價(jià)鉻能對(duì)大鼠的胚胎造成損傷，影響仔鼠的生殖與發(fā)育［5-6］。本研究探討不同濃度重鉻酸鉀對(duì)大鼠仔鼠肺臟的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，合格證號(hào)：No.110011 1911015206，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠毛發(fā)有光澤，身體狀況和食欲良好。將大鼠雌雄分開(kāi)并置于室內(nèi)（24±1）℃進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，待實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 重鉻酸鉀（山東西亞化學(xué)股份有限公司，純度99.8%）；JA2003B電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（Heal Force，PL-203）；純水儀（青島富勒姆科技FBZ2001-UP-P）；微型旋渦混合器（Servicebio，MX-F）；水浴鍋（姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司，TL-420D）；全自動(dòng)研磨儀（武漢康濤科技有限公司）；自動(dòng)洗板機(jī)（Rayto KZ-Ⅱ）；酶標(biāo)檢測(cè)儀（BioTeK，Epocchao）；超聲細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物，JY92-‘’Ⅱn）；生理鹽水（0.9%）；ELISA試劑盒（聯(lián)科生物）。

1.3 溶液配制 將重鉻酸鉀晶體配制成1/2LD50、1/4LD50、1/8LD50的溶液各500mL，保存于冰箱中（4℃），以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)大鼠灌胃所需。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)

1.4.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)。共分四組，即空白組，低、中、高濃度組，每組2只雌鼠，1只雄鼠。在適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后于上午9點(diǎn)合籠，雌雄比2∶1。第二天上午9點(diǎn)做陰道涂片，檢測(cè)雌鼠是否成功受孕。以從顯微鏡下觀察到精子為懷孕第一天，次日起開(kāi)始灌胃。每天根據(jù)雌鼠體重取相應(yīng)量重鉻酸鉀進(jìn)行灌胃，正常飼料和水喂養(yǎng)大鼠，直至生出仔鼠后斷奶。仔鼠斷奶后，對(duì)飲食及運(yùn)動(dòng)進(jìn)行觀察，取仔鼠肺臟，用濾紙對(duì)組織表面進(jìn)行脫水，電子天平稱量組織塊，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定正式試驗(yàn)重鉻酸鉀濃度。肺組織勻漿操作步驟：①?gòu)姆闻K組織取下大小為3mg的塊狀組織。②將組織塊置于生理鹽水（4℃）中，反復(fù)漂洗三次，以去除組織塊內(nèi)的血液，用濾紙拭干組織塊表面水分。③組織塊稱重后將其放入燒杯。④用移液管量取4℃的生理鹽水于燒杯內(nèi)，且生理鹽水總體積與肺組織塊重量之比為9∶1，使組織塊浸泡于生理鹽水中。⑤在冰水浴條件下，將浸泡的組織塊用眼科剪快速剪碎。⑥剪碎的組織塊超聲粉碎，制備成10%肺組織勻漿，然后用移液槍移入離心管，以3000r/min，離心10min。⑦移液槍取上清液，用ELISA法測(cè)定炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。運(yùn)用HE染色對(duì)仔鼠肺組織進(jìn)行染色，觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.2 正式試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1/2LD50、1/4LD50、1/8LD50重鉻酸鉀溶液對(duì)肺有一定影響，且老鼠存活率較高，所以正式試驗(yàn)依舊采用此濃度重鉻酸鉀溶液。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)方法，將雌鼠分四組，空白組，低、中、高濃度染毒組。其中空白組3只雌鼠，低、中、高染毒組各4只雌鼠。將大鼠按照雌雄比2∶1的比率合籠，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)定雌鼠懷孕日期并記錄，于次日開(kāi)始對(duì)大鼠染毒，連續(xù)灌胃至仔鼠出生后斷奶（21天），各組仔鼠數(shù)量（不分雌雄），空白組18只、低濃度組22只、中濃度組14只、高濃度組24只。每組取8只仔鼠斷奶后取肺臟，濾紙脫水，稱重計(jì)算臟器系數(shù)。每組取4只仔鼠采用ELISA法檢測(cè)肺組織勻漿中的TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子含量，對(duì)肺組織進(jìn)行HE染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺臟臟器系數(shù)比較 各濃度重鉻酸鉀組大鼠子一代的臟器系數(shù)均高于空白組（P＜0.05），且隨著重鉻酸鉀濃度升高，肺臟臟器系數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組肺臟臟器系數(shù)比較（%，±s）

表1 各組肺臟臟器系數(shù)比較（%，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05

?

2.2 各組TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 各濃度重鉻酸鉀組的大鼠子一代的TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子的濃度均高于空白組（P＜0.05），且隨著重鉻酸鉀濃度升高，各炎癥因子濃度增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（pg/mL，±s）

表2 各組TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（pg/mL，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05

?

2.3 HE染色 不同濃度重鉻酸鉀染毒仔鼠與空白組小鼠肺組織HE染色切片對(duì)比，隨著重鉻酸鉀濃度上升，肺組織形態(tài)學(xué)變化越加明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度HE染色 40×

3 討論

重鉻酸鉀中的鉻為六價(jià)，六價(jià)鉻具有強(qiáng)氧化性，而六價(jià)形態(tài)的鉻可對(duì)大鼠的卵黃囊有損傷，且能夠透過(guò)大鼠的胎盤屏障［7］，其強(qiáng)氧化性可對(duì)親代大鼠臟器及親代胚胎發(fā)育形成一定損害。母乳喂養(yǎng)子一代也可能是六價(jià)鉻進(jìn)入子一代體內(nèi)方式之一，以上兩種方式進(jìn)入子一代的六價(jià)鉻可能對(duì)子一代的肺臟形成損傷，致使肺臟臟器系數(shù)及相關(guān)炎癥因子發(fā)生變化。肺臟的臟器系數(shù)增大表示肺臟存在充血、水腫或增生肥大等病理變化［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的重鉻酸鉀組臟器系數(shù)均較空白組升高，說(shuō)明重鉻酸鉀可能會(huì)導(dǎo)致子一代的肺臟出現(xiàn)上述各種病理變化，且子一代臟器系數(shù)隨著重鉻酸鉀的濃度升高而升高，表明重鉻酸鉀可對(duì)子一代肺臟發(fā)育形成毒性損害。TNF-α，IL-1β和IL-6均為促炎細(xì)胞因子［9-10］，炎癥因子濃度升高表明子一代肺臟受損，高、中、低重鉻酸鉀組與空白組相比肺組織勻漿的炎癥因子TNF-α，IL-1β及IL-6的濃度均高于空白組，且隨著重鉻酸鉀濃度的增高，組織勻漿的炎癥因子TNF-α，IL-1β及IL-6的濃度也相應(yīng)增高。說(shuō)明重鉻酸鉀可導(dǎo)致仔鼠肺臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，其炎癥程度隨著重鉻酸鉀濃度的增加而增加，但是其損傷機(jī)制需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)研究證實(shí)。仔鼠的肺組織HE染色切片顯示，隨著重鉻酸鉀濃度的增高，子一代的肺間質(zhì)炎性細(xì)胞逐漸增生，組織細(xì)胞水腫逐漸嚴(yán)重，而間質(zhì)血管逐漸消失。說(shuō)明給予親代大鼠灌胃的重鉻酸鉀濃度越高，對(duì)子一代大鼠肺臟影響越大。

綜上所述，重鉻酸鉀可對(duì)子一代大鼠的肺臟造成損傷，且隨著重鉻酸鉀濃度的增加，子一代肺臟損傷越嚴(yán)重。