舒洛地特調(diào)控miR-27a介導(dǎo)自噬調(diào)控糖尿病腎病足細(xì)胞損傷機(jī)制研究

徐靜琳　孔祥靜　　韓穎敏　　陶海英

[關(guān)鍵詞] 舒洛地特;微小RNA-27a;自噬;糖尿病腎病;足細(xì)胞損傷

[中圖分類號(hào)] R285.5;R587.205? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）14-0039-06

Mechanism research of sulodexide in regulating miR-27a-mediated autophagy in regulation of podocyte injury in diabetic nephropathy

XU Jinglin1? ?KONG Xiangjing1? ?HAN Yingmin1? ?TAO Haiying2

1.Department of Nephrology， the First People′s Hospital of Taizhou City in Zhejiang Province， Taizhou? ?318000， China; 2.Department of Endocrinology， the First People′s Hospital of Taizhou City in Zhejiang Province， Taizhou 318000， China

[Abstract] Objective To analyze the mechanism of sulodexide in regulating microRNA-27a（miR-27a）-mediated autophagy in the regulation of podocyte injury in diabetic nephropathy. Methods Fifteen of the 45 rats were selected as the normal group without any treatment， and the remaining rats were used to establish a diabetic nephropathy rat model and randomly divided into the model group and the sulodexide group with 15 rats in each group. Rats in the sulodexide group were given intramuscular injection of sulodexide， while those in the normal group and the model group were given intramuscular injection of equal volume of normal saline. Histopathological changes， blood glucose， blood lipid and renal function indexes， podocyte autophagosome status， apoptosis rates， and podocyte specific protein expression levels， including Nephrin， Desmin， GPR124， miR-27a and AMPK-mtor signaling pathway protein were observed. Results The blood glucose， lipid and renal function indexes， podocyte apoptosis rates， Desmin， miR-27a and AMPK-mtor signaling pathway protein expression levels in the sulodexide group were lower than those in the model group，with significant difference（P<0.05）. The number of podocyte autophagosomes， the protein expression of Nephrin and GPR124 in the sulodexide group were higher than those in the model group，with significant difference（P<0.05）. Conclusion Sulodexide can mediate the reduction of the expression of AMPK， mTOR and Bax proteins by decreasing miR-27a， and then inhibit the AMPK-mTOR signaling pathway， promote autophagy， inhibit apoptosis and reduce the injury of podocytes in diabetic nephropathy.

[Key words] Sulodexide; miR-27a; Autophagy; Diabetic nephropathy; Podocyte injury

隨著人們生活水平的不斷提高，糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，其中糖尿病腎?。―iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，目前已成為導(dǎo)致終末期腎?。‥nd-stage renal disease，ESRD）的主要原因之一[1-2]。有數(shù)據(jù)顯示[3]，我國DKD的患病率為20%～40%，此病起病較為隱匿，一旦進(jìn)入大量蛋白尿期后，進(jìn)展至ESRD的速度顯著加快，因此，早期診斷、預(yù)防與延緩DKD的發(fā)生發(fā)展對(duì)提高DKD患者存活率、改善其生活質(zhì)量具有重要意義。有研究顯示[4]，微小RNA-27a（microRNA-27a，miR-27a）在DKD患者體內(nèi)呈異常高表達(dá)，可刺激系膜細(xì)胞外基質(zhì)合成增加即降解減少，加重DKD進(jìn)展。目前臨床研究證實(shí)[5]，舒洛地特是從動(dòng)物小腸分離提取沉淀而成的一種天然血管壁糖胺聚糖，具有較高的血管趨向性且對(duì)糖尿病尿蛋白的發(fā)生具有防治作用。但miR-27a在DKD中的調(diào)控機(jī)制尚未十分清楚，故本研究旨在探討舒洛地特調(diào)控miR-27a介導(dǎo)自噬調(diào)控糖尿病腎病足細(xì)胞損傷機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取45只雄性SPF級(jí)大鼠，購自冠科生物技術(shù)（中山）有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（粵）2020-0240，平均體重（218.63±32.45）g，在相對(duì)濕度為30%～35%、平均溫度（23.8±1.5）℃下飼養(yǎng)1周，每日光照24 h。本實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格參照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，且獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意。

1.2方法

1.2.1 儀器及試劑? 血糖儀、血糖試紙購自上海信帆生物科技有限公司;普通光學(xué)顯微鏡購自上海普赫光電科技有限公司;鏈尿佐菌素（Streptozotocin，STZ）購自上海恪敏生物科技有限公司;AMPK抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司;mTOR抗體購自愛必信（上海）生物科技有限公司;Bax抗體購自上海振譽(yù)生物科技有限公司。

1.2.2 分組及建模? 選取45只中15只大鼠作為正常組不做任何處理，其余大鼠均參照鄧文榮等[6]研究建立糖尿病腎病大鼠模型，隨機(jī)分為模型組、舒洛地特組各15只，大鼠均使用高糖高脂的飼料喂養(yǎng)2周后腹腔注射50 mg/kg避光溶解于pH=4.28檸檬酸鈉緩沖液的STZ溶液，注射7 d后取大鼠尾部靜脈血進(jìn)行空腹血糖監(jiān)測并收集尿液監(jiān)測尿肌酐、尿微量白蛋白，建模成功標(biāo)準(zhǔn)：血糖水平≥16.7 mmol/L及尿肌酐、尿微量白蛋白顯著高于正常組;此外，正常組常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.3 給藥方法? 舒洛地特組大鼠給予10 mg/（kg·d）舒洛地特肌內(nèi)注射，正常組和模型組給予等體積生理鹽水肌內(nèi)注射。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 病理組織學(xué)觀察? 在大鼠建模成功后12周，采用2%戊巴比妥鈉對(duì)大鼠麻醉后暴露其心臟，采用快速針刺入心尖部采血;隨后頸椎脫臼法處死小鼠并迅速解剖摘取其腎臟，將腎臟縱向?qū)Π肭虚_并去除筋膜，取1/4腎組織固定于使用冷生理鹽水漂洗后去除血液，使用濾紙吸干。采用10%福爾馬林固定后，將固定液倒出并用水沖洗浸泡1 d，換水1 h/次，將組織修出平整的切面，使用乙醇進(jìn)行分級(jí)梯度脫水，將標(biāo)本置于二甲苯溶液中并擰緊蓋子，更換二甲苯40 min/次，進(jìn)行透明處理，將標(biāo)本置于58℃箱內(nèi)，90 min/次，重復(fù)2次，進(jìn)行透臘處理，將其常規(guī)切片、封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.3.2 血糖、血脂和腎功能指標(biāo)評(píng)價(jià)? 采用上海帝博思生物科技有限公司的PUZS-300全自動(dòng)生化分析儀檢測血糖（Blood sugar，BG）、三酰甘油（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、血肌酐（Serum creatinine，Scr）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、24 h尿白蛋白排泄量（Urinary albumin excretion，UAE）。

1.3.3 足細(xì)胞自噬體情況、凋亡率評(píng)價(jià)? 采用上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司的透射電鏡觀察足細(xì)胞自噬體情況;采用默瑞（上海）生物科技有限公司的DxFLEX流式細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞凋亡率

1.3.4 足細(xì)胞特異性蛋白腎病蛋白（Nephrotic protein，Nephrin）、結(jié)蛋白（Desmin）、G-蛋白偶聯(lián)受體124（G protein-coupled receptor 124，GPR124）評(píng)價(jià)? 采用RT-PCR法檢測Nephrin、Desmin、GPR124表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟：將1 mL TRNzol加入癌組織、癌旁組織取總DNA并檢測其純度和濃度，提取2 μg總DNA并加入內(nèi)參GAPDH及目的小分子RNA Nephrin、Desmin、GPR124逆轉(zhuǎn)錄引物，42℃ 15 min，85℃ 5 s，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性10 min，95℃、60℃、95℃、60℃、95℃時(shí)間分別12 s、40 s、15 s、30 s、15 s（收集熒光），40個(gè)循環(huán)，使用Primer5.0軟件對(duì)引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，Nephrin引物序列上游：5'-CCTGTGAAACCTCGGGAATA-3'，下游：5'-GACCGAGTCAGGAACGAATA-3';Desmin引物序列上游：5'-TGAAGAGGAGATCCGTGAG-3'，下游：5'-AGTGAGGTCTGGCTTAGA-3';GPR124引物序列上游：5'-ATGGAGCTGAGCGCCTTTCCC-3'，下游：5'-TCCAACCCAAGGTCAGGCCCAT-3';內(nèi)參GAPDH引物序列上游：5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3'，下游：5'-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3'。

1.3.5 miR-27a、單磷酸腺苷活化蛋白激酶（Adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià)? 采用Western blot法檢測腎臟組織miR-27a、AMPK-mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)步驟：將腎臟組織接種于6孔板中，24 h貼壁后各組進(jìn)行處理，將采集到的樣本研磨加入蛋白緩沖液，提取細(xì)胞蛋白并使用BCA法測定濃度，制備電泳樣品，上樣量50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入脫脂奶粉封閉1 h，一抗（1∶1000）4℃ 孵育過夜，洗膜5 min/次，共3次，二抗（1∶4000）室溫孵育1 h，洗膜5 min/次，共3次，加入發(fā)光液曝光3～4次，取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠病理組織學(xué)觀察

正常組腎組織形態(tài)未見明顯異常，腎間質(zhì)、腎小球和腎小管的結(jié)構(gòu)基本正常;模型組腎組織可見腎小球毛細(xì)血管袢肥大、系膜基質(zhì)增多、腎小囊腔狹窄及腎小管出現(xiàn)管腔擴(kuò)張、纖維化或萎縮，出現(xiàn)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤，且可見空泡樣變性，上皮細(xì)胞出現(xiàn)變形、脫落和部分壞死;舒洛地特組腎臟病理損傷較模型組可見有所減輕。

2.2 各組大鼠血糖、血脂和腎功能指標(biāo)比較

舒洛地特組、模型組血糖、血脂和腎功能指標(biāo)均高于正常組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;舒洛地特組血糖、血脂和腎功能指標(biāo)均低于模型組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 各組大鼠足細(xì)胞自噬體情況、凋亡率比較

正常組大鼠足細(xì)胞足突正常、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常;模型組大鼠足突明顯增寬、融合，基底膜明顯增厚，足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷明顯且呈空泡樣變;舒洛地特組較模型組足突融合及基底膜增厚明顯減輕，足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷有所減輕。見圖1～2。舒洛地特組、模型組足細(xì)胞自噬體數(shù)量少于正常組，凋亡率高于正常組，，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;舒洛地特組足細(xì)胞自噬體數(shù)量多于模型組，凋亡率低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠足細(xì)胞特異性蛋白Nephrin、Desmin、GPR124蛋白表達(dá)量比較

舒洛地特組、模型組Desmin蛋白表達(dá)量高于正常組，Nephrin、GPR124蛋白表達(dá)量低于正常組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;舒洛地特組Desmin蛋白表達(dá)量低于模型組，Nephrin、GPR124蛋白表達(dá)量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.5 各組大鼠miR-27a、AMPK-mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較

舒洛地特組、模型組miR-27a、AMPK-mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)量均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;舒洛地特組miR-27a、AMPK-mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

DKD的病理發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常、血糖值高導(dǎo)致的代謝變化、高血壓及血管活性物質(zhì)代謝異樣及遺傳因素等影響，目前臨床上治療DKD的藥物存在療效長、副作用多及費(fèi)用昂貴等劣勢，進(jìn)一步探索DKD的發(fā)病機(jī)制，找尋安全有效治療策略一直是糖尿病領(lǐng)域的熱點(diǎn)話題[7-8]。有研究顯示[9-10]，舒洛地特在DKD治療中具有減少蛋白尿的腎臟保護(hù)作用，還具有抗凝、抗栓、保護(hù)血管內(nèi)皮等作用，其作用機(jī)制可能為舒洛地特可補(bǔ)充DKD患者丟失的陰離子成分糖胺聚糖（Glycosaminoglycans，GAGs）、修補(bǔ)腎小球基底膜結(jié)構(gòu)并恢復(fù)電荷屏障以減少尿蛋白丟失，降低DKD患者的尿蛋白水平。miRNA在人類的多種疾病中均可發(fā)揮調(diào)控作用，其在糖尿病腎病中亦具有重要作用，miR-27a-3p在DKD患者體內(nèi)呈異常高表達(dá)，高表達(dá)miR-27a-3p對(duì)腎纖維化具有促進(jìn)作用[11]。本研究結(jié)果顯示，舒洛地特可下調(diào)miR-27a表達(dá)，對(duì)腎纖維化起一定的保護(hù)作用，為DKD的治療奠定基礎(chǔ)。

DKD的病理改變包括腎小球細(xì)胞外基質(zhì)積累及基底膜增厚，但特征性標(biāo)志為蛋白尿，但越來越多研究發(fā)現(xiàn)[12]，足細(xì)胞參與DKD蛋白尿的發(fā)生，是DKD發(fā)病與進(jìn)展的中心靶點(diǎn)。足細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，其再生能力有限，在糖尿病等應(yīng)激因素的作用下，大量的蛋白和細(xì)胞器積聚在足細(xì)胞內(nèi)并產(chǎn)生毒性作用，若未得到有效清除將會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡或死亡，進(jìn)而引起足細(xì)胞損傷和功能失調(diào)等不可逆性變化并導(dǎo)致足細(xì)胞缺失[13-14]。在正常情況下，足細(xì)胞有著較高的自噬活性可清除受損的蛋白和細(xì)胞器，從而免受損傷。本研究結(jié)果顯示，DKD患者體內(nèi)足細(xì)胞存在一定損傷，舒洛地特可通過下調(diào)miR-27a介導(dǎo)自噬，緩解DKD足細(xì)胞損傷，延緩疾病進(jìn)展。

臨床上將Nephrin視為腎小球足細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志物，其是構(gòu)建足細(xì)胞裂空隔膜的關(guān)鍵蛋白且特異性地在腎小球足細(xì)胞中表達(dá)，在高糖等應(yīng)激條件下易導(dǎo)致Nephrin表達(dá)減少，從而導(dǎo)致裂空隔膜破壞和大量蛋白尿[15]。在吳欣等[16]研究中，Desmin是一種細(xì)胞骨架中間絲蛋白，在正常情況下僅在系膜細(xì)胞中少量表達(dá)，但當(dāng)足細(xì)胞受損時(shí)，其表達(dá)顯著增加，故可作為足細(xì)胞損傷的標(biāo)志蛋白。GPR124為G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPR）家族中的孤兒受體，其在DKD患者體內(nèi)呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞的自噬功能、減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)足細(xì)胞功能的保護(hù)作用[17]。本研究結(jié)果顯示，足細(xì)胞內(nèi)可通過下調(diào)miR-27a促進(jìn)Desmin蛋白表達(dá)量下調(diào)，Nephrin、GPR124蛋白表達(dá)量上調(diào)，進(jìn)而緩解足細(xì)胞損傷，對(duì)足細(xì)胞發(fā)揮一定保護(hù)作用。

臨床研究證實(shí)[18-19]，AMPK-mTOR信號(hào)通路表達(dá)異常在DKD足細(xì)胞損傷中起著重要作用，可通過對(duì)此信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而激活足細(xì)胞自噬、改善足細(xì)胞損傷，起到抗DKD的作用。AMPK是一種重要的受體且是自噬的主要調(diào)節(jié)劑，活化的AMPK對(duì)mTOR具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，在富含氨基酸和生長因子營養(yǎng)充足時(shí)，細(xì)胞中mTOR被大量激活并阻斷自噬通路[20]。mTOR是抑制自噬過程的一個(gè)主要因素，其主要通過磷酸化下游靶蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬過程的抑制，足細(xì)胞mTOR的激活在DKD進(jìn)展過程中表現(xiàn)出非常重要的作用，減少足細(xì)胞mTOR的激活可延緩DKD的進(jìn)展[21]。mTOR可刺激缺氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的堆積，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的分泌及表達(dá)，進(jìn)而加速DKD的進(jìn)展。Bax在病變生物體內(nèi)呈低表達(dá)，參與機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞的增殖、凋亡過程，其中細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)連續(xù)的程序化反應(yīng)，Bax過剩有助于細(xì)胞死亡[22]。本研究結(jié)果證實(shí)AMPK-mTOR信號(hào)通路參與糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中自噬的調(diào)節(jié)，其機(jī)制可能為通過調(diào)節(jié)此信號(hào)通路相關(guān)蛋白進(jìn)一步激活自噬，足細(xì)胞損傷情況也隨著自噬的激活而有所改善。

綜上所述，舒洛地特可通過下調(diào)miR-27a抑制AMPK-mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)自噬調(diào)控糖尿病腎病足細(xì)胞損傷并發(fā)揮對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用，為臨床治療DKD提供了新的理論依據(jù)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的科學(xué)研究。

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（收稿日期：2020-06-03）