基于氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的腎性高血壓大鼠模型糞便代謝組學(xué)分析

閆宇涵，王占黎，胡海，劉秀芬

繼發(fā)性高血壓是病因明確的高血壓，腎性高血壓為繼發(fā)性高血壓的組成部分［1］。高血壓是許多疾病包括心血管疾病、糖尿病、腦卒中等的危險(xiǎn)因素且影響著人類的身心健康［2］，國(guó)際上罹患腎性高血壓的人數(shù)占高血壓總?cè)藬?shù)的百分比呈逐年上升趨勢(shì)［3-4］。近年臨床上關(guān)于腎性高血壓的研究較多，兩腎一夾（2K1C）腎性高血壓大鼠模型作為最常使用的繼發(fā)性高血壓動(dòng)物模型對(duì)于腎性高血壓的研究尤為重要［5］。近年糞便代謝組學(xué)的研究逐漸興起，糞便內(nèi)源性代謝物的變化與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，代謝物被認(rèn)為可直接反映個(gè)體生理和病理狀況，已有研究表明，糞便內(nèi)源性代謝物的改變與糖尿病、高脂血癥等存在緊密聯(lián)系［6-8］，此外其還可能與高血壓的發(fā)病有關(guān)［9-10］。但目前關(guān)于高血壓大鼠腸道糞便內(nèi)源性代謝物的研究，特別是腎性高血壓大鼠腸道糞便內(nèi)源性代謝物的研究鮮有報(bào)道。本研究構(gòu)建2K1C腎性高血壓大鼠模型并通過(guò)氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC-TOFMS）技術(shù)檢測(cè)大鼠糞便代謝產(chǎn)物的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019-08-15至2019-09-30。選取4周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠20只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006〕，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=10）和模型組（n=10）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要儀器 BP-300A全自動(dòng)大小鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司，7890氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀購(gòu)自Agilent，質(zhì)譜儀購(gòu)自LECO，離心機(jī)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific，超低溫冰箱購(gòu)自Thermo Fisher Scientific，分析天平購(gòu)自Sartorius，研磨儀購(gòu)自上海凈信科技有限公司，超聲儀購(gòu)自深圳市方奧微電子有限公司，烘箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，真空干燥儀購(gòu)自太倉(cāng)市華美生化儀器廠。

1.2.2 模型制備方法 常規(guī)無(wú)菌操作，兩組大鼠均給予3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，打開腹腔。模型組大鼠構(gòu)建2K1C腎性高血壓大鼠模型［5］，具體如下：在大鼠左腎動(dòng)脈中段夾閉一個(gè)內(nèi)徑為0.2 mm的銀夾，以造成腎臟缺血；假手術(shù)組大鼠打開腹腔后進(jìn)行左腎動(dòng)脈分離但不夾閉。密切關(guān)注大鼠生命體征36 h，術(shù)后72 h內(nèi)每只大鼠每天給予青霉素0.5萬(wàn)U，共計(jì)3 d。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠尾動(dòng)脈收縮壓較造模前升高30 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）視為造模成功。術(shù)后4周處死大鼠，并在無(wú)菌條件下收集兩組大鼠糞便樣本及左、右腎，采用濾紙吸干左、右腎表面水分，采用直尺測(cè)量左、右腎寬，觀察腎臟體積。

1.2.3 血壓、體質(zhì)量測(cè)量方法 每周固定時(shí)間采用尾套法測(cè)量?jī)山M大鼠尾動(dòng)脈收縮壓并記錄，測(cè)量血壓時(shí)提前將大鼠放入固鼠器中固定完畢，并放于提前預(yù)熱的血壓測(cè)量系統(tǒng)中，待大鼠預(yù)熱完畢后，即大鼠血壓波形穩(wěn)定后測(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓3次并記錄，每次間隔1 min，隨后測(cè)定大鼠體質(zhì)量并記錄。血壓測(cè)量完畢待大鼠體溫恢復(fù)正常后，放回飼養(yǎng)間。記錄兩組大鼠術(shù)后即刻、術(shù)后4周尾動(dòng)脈收縮壓、體質(zhì)量。

1.2.4 代謝組學(xué)檢測(cè)方法

1.2.4.1 代謝物提取 采用GC-TOFMS技術(shù)檢測(cè)大鼠糞便代謝物，具體如下：取樣本（50±1）mg放入EP管（2 ml）中，加入500 μl預(yù)冷提取液（甲醇與氯仿的體積比為3∶1），再加入核糖醇10 μl，渦旋30 s；加入鋼珠，將研磨儀調(diào)至45 Hz處理4 min，冰水浴超聲5 min；將樣本放入離心機(jī)中離心15 min；小心移取200 μl上清液于1.5 ml EP管中，從每個(gè)樣本中取60 μl混合制成QC樣本；于真空干燥儀中干燥處理提取物；然后加入40 μl甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶20 mg/ml）并輕輕搖勻，并放入80 ℃烘箱中孵育30 min；向每個(gè)樣品中加入50 μl BSTFA〔含有1%三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMCS），v/v〕，然后將得到的混合物于70 ℃孵育1.5 h后冷卻至室溫，再向混合的樣品中加入5 μl可溶于氯仿的脂肪酸甲酯（fatty acid methyl esters，F(xiàn)AMEs）；隨機(jī)順序上機(jī)檢測(cè)差異糞便代謝物。

1.2.4.2 上機(jī)檢測(cè) 氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀具體上機(jī)檢測(cè)參數(shù)見表1。

表1 氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)參數(shù)Table 1 Test parameters for GC-TOFMS instrument

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。本研究中計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；采用正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）模型檢驗(yàn)兩組樣本組間和組內(nèi)差異，采用置換檢驗(yàn)分析OPLS-DA模型的可靠性及是否存在過(guò)擬合現(xiàn)象。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟體積、尾部動(dòng)脈壓及體質(zhì)量 模型組大鼠均建模成功。術(shù)后4周，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠左側(cè)腎臟體積明顯縮小、且形態(tài)萎縮。術(shù)后即刻兩組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓和體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后4周模型組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓高于假手術(shù)組，體質(zhì)量低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后4周模型組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓高于術(shù)后即刻，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后4周假手術(shù)組和模型組大鼠體質(zhì)量分別高于本組術(shù)后即刻，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組大鼠術(shù)后即刻和術(shù)后4周尾動(dòng)脈收縮壓和體質(zhì)量比較（±s）Table 2 Comparison of systolic blood pressure of tail artery and body mass between the two groups immediately after operation and 4 weeks after operation

表2 兩組大鼠術(shù)后即刻和術(shù)后4周尾動(dòng)脈收縮壓和體質(zhì)量比較（±s）Table 2 Comparison of systolic blood pressure of tail artery and body mass between the two groups immediately after operation and 4 weeks after operation

注：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組1只大鼠死亡

組別 只數(shù) 尾動(dòng)脈收縮壓（mm Hg） 體質(zhì)量（g）術(shù)后即刻 術(shù)后4周 t配對(duì)值 P值 術(shù)后即刻 術(shù)后4周 t配對(duì)值 P值假手術(shù)組 10 100±14 104±8 -1.460 0.178 213.8±12.6 284.9±26.9 -11.002 ＜0.001模型組 9 106±12 195±14 -13.629 ＜0.001 209.7±15.6 256.4±46.5 -5.146 ＜0.001 t值 1.276 -14.510 1.453 2.609 P值 0.178 ＜0.001 0.137 0.043

2.2 OPLS-DA結(jié)果 OPLS-DA結(jié)果顯示，兩組樣本區(qū)分非常明顯，均在95%CI內(nèi)，見圖1。置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示，構(gòu)建的OPLS-DA模型符合真實(shí)情況，無(wú)過(guò)擬合現(xiàn)象，見圖2。

圖1 兩組OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖Figure 1 Scatter plot of OPLS-DA model score of the two groups

圖2 構(gòu)建的OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)結(jié)果Figure 2 Permutation test result of OPLS-DA model constructed

2.3 差異糞便代謝物 基于GC-TOFMS技術(shù)及多元變量統(tǒng)計(jì)分析方法［11］，共篩選出11種差異糞便代謝物：與假手術(shù)組相比，模型組葡萄糖酸、肌醇、壬酸、癸酸呈低表達(dá)，葡萄糖-1-磷酸、麥芽三糖醇、異麥芽酮糖、馬來(lái)酸、2-甲基戊二酸、2-單棕櫚酸甘油酯、L-犬尿氨酸呈高表達(dá)，見表3、圖3。

表3 兩組差異糞便代謝物篩選結(jié)果Table 3 Screening results of different fecal metabolites of the two groups

圖3 兩組差異糞便代謝物層次聚類分析熱力圖Figure 3 Heatmap of hierarchical clustering analysis of different fecal metabolites of the two groups

3 討論

腎性高血壓主要由腎動(dòng)脈及腎實(shí)質(zhì)性病變引起，而腎動(dòng)脈病變主要為腎動(dòng)脈內(nèi)壁發(fā)生的一系列病變，如肌纖維增生、小動(dòng)脈瘤形成，進(jìn)而使腎動(dòng)脈內(nèi)壁突出，造成腎動(dòng)脈狹窄、缺血，最終導(dǎo)致腎性高血壓［12-13］。高血壓常與代謝異常并存，二者可能存在共同的潛在機(jī)制，包括腸道激素改變、腸鈉吸收和腸道菌群改變［14-15］。因此，改善胃腸系統(tǒng)可能是糾正代謝異常、降低血壓的選擇。

本研究基于GC-TOFMS技術(shù)及多元變量統(tǒng)計(jì)分析方法，共篩選出11種差異糞便代謝物：與假手術(shù)組相比，模型組葡萄糖酸、肌醇、壬酸、癸酸呈低表達(dá)，葡萄糖-1-磷酸、麥芽三糖醇、異麥芽酮糖、馬來(lái)酸、2-甲基戊二酸、2-單棕櫚酸甘油酯、L-犬尿氨酸呈高表達(dá)。

肌醇主要存在于肌肉、心臟和肝臟中，CHANG等［16］通過(guò)動(dòng)物模型證實(shí)高血壓大鼠腎臟中肌醇含量下降。OMORI等［17］比較冠心病與正常受試者血清代謝組學(xué)，發(fā)現(xiàn)冠心病患者血清壬酸水平低于正常受試者。葡萄糖-1-磷酸是葡萄糖上1'-碳原子磷酸化作用的結(jié)果，在高血壓病理生理過(guò)程中常伴隨能量的消耗、體內(nèi)儲(chǔ)存糖原的分解，而葡萄糖-1-磷酸是糖原消耗反應(yīng)的產(chǎn)物［18-19］。麥芽三糖醇可被腎臟中的α-葡萄糖苷酶水解為葡萄糖［20］，而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）可抑制腎臟中的α-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖［21-22］、促進(jìn)血管緊張素Ⅰ（angiotensin I，AngⅠ）生成，而AngⅠ又是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensinaldosteronesystem，RAAS）調(diào)節(jié)血壓的重要一環(huán)。異麥芽酮糖是由葡萄糖和果糖單體組成的二糖，其可為機(jī)體代謝提供能量。DE GROOT等［23］研究證實(shí)，異麥芽酮糖可以保留動(dòng)脈內(nèi)皮功能的潛力，在心血管健康中發(fā)揮有利作用，而高血壓等心血管疾病的早期征兆與動(dòng)脈內(nèi)皮功能受損有關(guān)。L-犬尿氨酸是色氨酸代謝產(chǎn)物的一種，也是有效的血管舒張劑，在高血壓發(fā)病機(jī)制中其可使血管舒張、血管通透性增加，促進(jìn)血管因子釋放［24］。目前，葡萄糖酸、癸酸、馬來(lái)酸、2-甲基戊二酸、2-單棕櫚酸甘油酯與高血壓的關(guān)系尚不清楚，仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，腎性高血壓大鼠糞便代謝物與假手術(shù)組明顯不同，本研究初步證明了腎性高血壓對(duì)腸道內(nèi)源性代謝物的影響，提示腸道菌群或可以作為治療腎性高血壓的新選擇，同時(shí)對(duì)后續(xù)研究腸道菌群和內(nèi)源性代謝物的關(guān)系提供了有力依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：閆宇涵進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，結(jié)果分析與解釋，撰寫論文；王占黎、胡海進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；劉秀芬進(jìn)行論文的修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。