擬南芥LHY基因超表達(dá)與成花轉(zhuǎn)變

尹晟，傅鈺，龍鴻

擬南芥基因超表達(dá)與成花轉(zhuǎn)變

尹晟，傅鈺，龍鴻通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392）

高等植物的成花轉(zhuǎn)變受到多個基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，植物從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L，與植物自身發(fā)育的生物節(jié)律相關(guān)，然而生物鐘（circadian clock）相關(guān)基因在其中的調(diào)控作用仍不清楚。本研究通過構(gòu)建超表達(dá)載體pCAMBIA-3301 -遺傳轉(zhuǎn)化后獲得超表達(dá)植株，分析超表達(dá)生物節(jié)律基因?qū)Τ苫ㄞD(zhuǎn)變的影響。結(jié)果表明，超表達(dá)植株具有18片蓮座葉，野生型植株為12片；超表達(dá)植株在第33天出現(xiàn)可見花芽，野生型植株則為20 d，超表達(dá)植株表現(xiàn)出晚花表型。莖端分生組織解剖結(jié)構(gòu)分析表明，超表達(dá)植株在第19天（野生型植株15 d）時生長錐持續(xù)生長發(fā)育，凸起明顯增高，具多層原套細(xì)胞，原體和髓分生組織細(xì)胞分裂，數(shù)量增多，說明超表達(dá)植株?duì)I養(yǎng)生長成熟期延遲，導(dǎo)致晚花。qRT-PCR對及其靶基因表達(dá)水平檢測結(jié)果表明，超表達(dá)植株的表達(dá)量隨植物發(fā)育進(jìn)程逐漸降低，而表達(dá)量則逐漸升高，超表達(dá)植株可能通過調(diào)控和的表達(dá)量來調(diào)控成花轉(zhuǎn)變。

擬南芥；成花轉(zhuǎn)變；基因；超表達(dá)

高等植物開花是由內(nèi)部基因和外界環(huán)境共同作用來完成。這個調(diào)節(jié)過程涉及錯綜復(fù)雜的信號通路。擬南芥作為研究植物開花調(diào)控途徑的模式植物，它對環(huán)境條件比較敏感并且適于利用遺傳學(xué)技術(shù)對其開花機(jī)制展開研究，目前對控制其開花時間尤其開花信號通路研究方面取得了很大進(jìn)展。環(huán)境因子是多種開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的組成部分，遺傳和分子生物學(xué)研究鑒定出4條調(diào)控植物開花的主要途徑：光周期途徑、自主開花途徑、春化途徑和赤霉素（GA）途徑[1-5]。

植物在長期進(jìn)化過程中，形成了隨著外界晝夜循環(huán)同步變化的內(nèi)在控制時長的生物學(xué)機(jī)制-生物節(jié)律鐘（circadian clocks），調(diào)控氣孔開閉、生長、光周期等生理過程[6]。光周期途徑中的核心調(diào)控蛋白CONSTANS（CO）與數(shù)個信號系統(tǒng)相連，如生物節(jié)律鐘和光信號的光受體[5]，光信號則與內(nèi)源生物節(jié)律鐘相關(guān)[7-8]。植物體內(nèi)生物節(jié)律鐘由四種不同但相關(guān)聯(lián)的調(diào)控組分組成。（1）早晨組分（morning complex），（2）中午組分（middle complex），（3）晚上組分（evening complex），（4）夜間組分（night complex）[9-12]。早晨時2種早晨組分（）和（）得到富集，并直接抑制其他三種組分的基因表達(dá)[13-14]。隨著一天中時間的推移，早晨組分受到其他三種組分的抑制并表現(xiàn)出隨時間漸次替代的特點(diǎn)[15-16]。

開花是果樹生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，調(diào)控果樹開花在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要意義。研究表明，小分子RNA（miRNAs）參與了成花轉(zhuǎn)變調(diào)控[17-20]。作為植物體內(nèi)生物節(jié)律鐘早晨組分之一，在一天內(nèi)調(diào)控表達(dá)，但它在成花轉(zhuǎn)變中的作用未知，尤其是與時間依賴的小RNA開花調(diào)控途徑的互作仍不清楚。本試驗(yàn)通過構(gòu)建超表達(dá)載體pCAMBIA- 3301-經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化后得到擬南芥超表達(dá)植株，研究超表達(dá)植株中的成花轉(zhuǎn)變過程，并探討及其靶基因在此過程中的作用，為基因與成花轉(zhuǎn)變之間的關(guān)聯(lián)提供試驗(yàn)依據(jù)，并可為果樹開花調(diào)控提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（L.）野生型Col-0種子由天津農(nóng)學(xué)院果樹學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 植株種植

方法參見文獻(xiàn)[21]。將擬南芥種子浸濕后置于培養(yǎng)皿中4 ℃春化3 d。點(diǎn)種到蛭石∶營養(yǎng)土＝1∶1的培養(yǎng)土中，人工氣候室培養(yǎng)。16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度180 μmol/（m2·s），溫度20～22 ℃，濕度為60%～80%。

1.2.2基因超表達(dá)載體的構(gòu)建

從TAIR數(shù)據(jù)庫中查找基因的序列信息，利用primer軟件輔助進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)，引物序列5＇-GCCATGGATACTAATACATCTGGA- 3＇，5＇-GGTCACCTCATGTAGAAGCTTC TC-3＇，擴(kuò)增部分包含編碼區(qū)。采用CTAB法提取植株葉片組織的總RNA；RT-PCR擴(kuò)增后獲得基因的全長基因序列，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目的基因進(jìn)行回收；使用試劑盒提取質(zhì)粒；對-T1-使用I和O65 I進(jìn)行雙酶切，將載體原有GUS基因切除，將目的基因插入該處與pCAMBIA-3301表達(dá)載體相連接，使用載體上原有基因的CaMV 35s啟動子和NOS終止子，獲得pCAMBIA-3301超表達(dá)載體。

1.2.3 獲取并檢測轉(zhuǎn)基因植株

獲得pCAMBIA-3301-超表達(dá)載體后，電擊轉(zhuǎn)化以獲得含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，對擬南芥（Col-0）花序使用浸花法進(jìn)行侵染，用抗性（除草劑Basta）進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選，篩選到T3代后獲得含有基因的轉(zhuǎn)基因陽性純合植株，并對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗性基因鑒定。

1.2.4 擬南芥形態(tài)學(xué)觀察

待野生型對照和超表達(dá)T3代植株的種子長出子葉后，開始觀察記錄野生型Col-0及超表達(dá)植株的形態(tài)學(xué)特征，方法參見文獻(xiàn)[21]。

1.2.5 石蠟切片的制作

方法參見文獻(xiàn)[21]。FAA固定液固定不同生長時期的擬南芥頂端分生組織，愛氏蘇木精整染 2 d，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，用LEICA RM2235切片機(jī)切片，切片厚度8 μm，在Olympus BX53顯微鏡下觀察，Spot Idea CCD相機(jī)拍照。

1.2.6 熒光實(shí)時定量PCR

以為內(nèi)參基因，通過熒光實(shí)時定量PCR進(jìn)行檢測不同時期植株中及靶基因的表達(dá)量變化，方法參見文獻(xiàn)[21]。引物序列：Actin-2-F，5＇-GCTGAGAGATTCAGATGCCCA-3＇，Actin-2-R，5＇-GTGGATTCCAGCAGCTTCCATACT-3＇，miR156-F，5＇-CATCTTGTAGATCTCTGA AGT TGGACT-3＇，-R，5＇-GAGATTGAGAC ATAGAGAACGAAGACA-3＇，-F，5＇-TGAG AAGAAGCAAAGCGGAA-3＇，-R，5＇-TAT CCGCGG TACAACTCTCG-3＇。

2 結(jié)果與分析

2.1 LHY基因超表達(dá)突變體的構(gòu)建及驗(yàn)證

以擬南芥Col-0野生型總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，PCR擴(kuò)增大小約1 900 bp的基因全長，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示：擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物與目的基因的片段大小一致，說明利用RT-PCR已將基因成功擴(kuò)增（圖1）。將擴(kuò)增得到的基因?qū)氲匠磉_(dá)載體，隨后將篩選得到的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。用農(nóng)桿菌浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)Basta篩選獲得T3代純合的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)試驗(yàn)。采用半定量RT-PCR方法鑒定野生型及轉(zhuǎn)基因植株的基因，T1、T2、T3代均能擴(kuò)增出405 bp的基因，說明基因在轉(zhuǎn)基因植株中可以表達(dá)（圖2）。

注：M：2 000 bp Marker；A：RNA；B：基因PCR產(chǎn)物

注：A，B，C分別為T1、T2、T3代，M：2 000 bp Marker；1：對照組 PCR；2～6：轉(zhuǎn)基因植株 PCR

2.2 超表達(dá)植株生長周期

為研究超表達(dá)植株生長周期，觀察并記錄蓮座葉總數(shù)。通過對野生型及超表達(dá)植株的生長觀察發(fā)現(xiàn)，野生型共12片蓮座葉（圖3-A），超表達(dá)植株共18片蓮座葉（圖3-B）。

進(jìn)一步觀察、統(tǒng)計(jì)、分析表明，野生型植株?duì)I養(yǎng)生長時間為20 d，之后完成從營養(yǎng)生長到開花的成花轉(zhuǎn)變；超表達(dá)植株的營養(yǎng)生長時間為33 d（表1）。這些結(jié)果表明：超表達(dá)植株產(chǎn)生的葉片數(shù)量多，營養(yǎng)生長時間長，比野生型成花轉(zhuǎn)變延遲。

注：A．野生型植株葉片；B. 超表達(dá)植株葉片。標(biāo)尺＝1 cm

表1 野生型及超表達(dá)植株蓮座葉發(fā)育狀況比較

注：營養(yǎng)生長時間指從播種日期到植株出現(xiàn)可見花芽的時間。與野生型對比，用檢驗(yàn)法對統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，**代表極顯著差異（≤0.01）

2.3 莖端分生組織結(jié)構(gòu)特征

為更好地分析植株成花轉(zhuǎn)變過程，以野生型和超表達(dá)植株莖端分生組織為材料制作石蠟切片，對莖端分生組織解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。野生型生長到第5天時，莖頂端分生組織生長錐呈平坦?fàn)睿▓D4a），第8天時，生長錐略有凸起，細(xì)胞為單層（圖4b），第10天時，莖頂端分生組織略有升高（圖4c），第13天時，莖頂端分生組織細(xì)胞增多，同時具有單層和多層細(xì)胞（圖4d），第15天時，生長錐持續(xù)生長發(fā)育，凸起明顯增高，具多層原套細(xì)胞，原體和髓分生組織細(xì)胞分裂，數(shù)量增多（圖4e），但均發(fā)育為葉原基，直到第20天時，花芽出現(xiàn)，分化出萼片原基、花瓣原基，而雄蕊原基、雌蕊原基略見雛形（圖4f）；超表達(dá)植株第5天莖端分生組織生長錐為平坦?fàn)睿▓D4g），第8、10、13、15天（圖4h～圖4k）莖端分生組織生長錐均開始出現(xiàn)凸起，且隨植物生長，凸起逐漸增高，細(xì)胞開始分裂，數(shù)目逐漸增多，莖端分生組織生長錐的凸起程度相比于野生型均較低，說明超表達(dá)植株?duì)I養(yǎng)生長緩慢，直至第19天（圖4I）時，莖端分生組織生長錐明顯凸起，出現(xiàn)多層細(xì)胞，此時開始進(jìn)入營養(yǎng)生長成熟期，仍然發(fā)育為葉原基，對比此時的野生型植株則花原基發(fā)育，開始出現(xiàn)花芽，此后繼續(xù)發(fā)育直至第33天出現(xiàn)明顯花芽（圖4m）。根據(jù)野生型及超表達(dá)植株的莖端分生組織生長發(fā)育情況對比發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)植株成花轉(zhuǎn)變延遲。

注：A～M為a～m切片取材時對應(yīng)的植株生長狀況

2.4 miR156及SPL3表達(dá)分析

隨著植株的生長發(fā)育，野生型及超表達(dá)植株中各個發(fā)育階段的表達(dá)量均出現(xiàn)下降趨勢（圖5）。野生型在第15天時表達(dá)量顯著下降，第19天時繼續(xù)下降，至第23天時，下降至更低水平，其后第25、30、33天，的表達(dá)量檢測不出。超表達(dá)植株中表達(dá)量在第8、10、13、15天也呈逐漸下降趨勢，但下降幅度不大，第19天時表達(dá)量明顯下降一倍左右，在隨后23、25、30 d繼續(xù)下降，至33 d出現(xiàn)花芽時達(dá)極低水平。超表達(dá)植株各時期表達(dá)量均比野生型高。

注：小寫字母表示在5%水平的顯著性。下同

同時，檢測野生型和超表達(dá)植株各生長發(fā)育中的的表達(dá)量。結(jié)果表明，各植株的表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢（圖6）。野生型在第8、10、13天時表達(dá)量逐漸上升，第15天時上升近3倍，后繼續(xù)上升至第23天達(dá)最大值。超表達(dá)植株在第8、10、13、15天依次上升，19 d時表達(dá)量上升2倍左右，隨后持續(xù)上升直至超表達(dá)植株生長到第33天時出現(xiàn)花芽，此時表達(dá)量處于最大值。超表達(dá)植株各時期表達(dá)量均比野生型低。

3 討論

成花轉(zhuǎn)變是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)目標(biāo)，其調(diào)控機(jī)制可以廣泛用于園藝作物遺傳改良，如縮短果樹童期以促進(jìn)實(shí)生苗盡早開花坐果，反季促成栽培調(diào)控蔬菜上市時間，控制花卉花期以適應(yīng)市場需求，都具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐價值，因此，成花轉(zhuǎn)變的分子調(diào)控機(jī)制受到廣泛關(guān)注。

光周期途徑是四條主要開花途徑之一，植物通過光周期途徑感受季節(jié)性變化，由一天之中的日照長度（日長）變化來調(diào)控許多植物的開花[5]。光信號與植物內(nèi)源生物節(jié)律鐘相聯(lián) 系[7-8]。光受體感應(yīng)的光信號傳導(dǎo)進(jìn)生物節(jié)律鐘系統(tǒng)，調(diào)解擬南芥的成花轉(zhuǎn)變[22-23]。但是生物節(jié)律鐘調(diào)控基因在成花轉(zhuǎn)變過程中的具體作用仍不清楚。

本研究通過觀察野生型及超表達(dá)植株的形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株比野生型植株蓮座葉葉片總數(shù)多，說明超表達(dá)植株?duì)I養(yǎng)生長發(fā)育緩慢，植株?duì)I養(yǎng)體的葉片數(shù)量與成花轉(zhuǎn)變之間存在直接聯(lián)系。此外，野生型植株在第20天出現(xiàn)抽薹，而超表達(dá)植株在第33天時才出現(xiàn)抽薹，說明與野生型相比，超表達(dá)植株生長速率緩慢。超表達(dá)導(dǎo)致植株產(chǎn)生晚花表型。

植株器官形態(tài)上的變化與頂端分生組織的發(fā)育情況相關(guān)。本研究通過石蠟切片觀察莖端分生組織生長錐的發(fā)育過程，對比野生型，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株莖端分生組織生長、發(fā)育、分化為葉原基的時間較長，花原基分化明顯晚于野生型，推測因?yàn)榛虻倪^量表達(dá)導(dǎo)致其莖端分生組織發(fā)育較晚使其成花轉(zhuǎn)變延遲。從解剖結(jié)構(gòu)細(xì)胞特點(diǎn)分析，超表達(dá)植株莖端分生組織的生長錐分化較遲，原套、原體和髓分生組織形成多細(xì)胞層較晚，致使?fàn)I養(yǎng)生長時間增長，成花轉(zhuǎn)變延遲。

隨著植株生長發(fā)育，野生型及超表達(dá)植株中表達(dá)水平均出現(xiàn)下降趨勢，而其靶基因的表達(dá)量則升高。是具有時間依賴的開花途徑調(diào)控功能的小RNA之一[24]，與基因家族一起參與調(diào)控植物開花進(jìn)程[25]。本研究中，野生型及超表達(dá)植株中各個發(fā)育階段和的表達(dá)量均分別呈現(xiàn)下降和上升趨勢，野生型至成花轉(zhuǎn)變時，超表達(dá)植株中表達(dá)維持較高，表達(dá)則較低，說明超表達(dá)植株可能通過調(diào)控和的表達(dá)量來調(diào)控成花轉(zhuǎn)變。

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The floral transition ofoverexpression plants in

Yin Sheng, Fu Yu, Long HongCorresponding Author

（College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

The floral transition in higher plants is regulated by multiple gene network. The transition of plants from vegetative growth to reproductive growth is related to the biological rhythm of plant development. However, the regulatory role of circadian clock-related genes in it is still unclear. By constructing the overexpression vector pCAMBIA-3301-35S::, and the following genetic transformation, the effects of overexpression of circadian clock-related geneon floral transition were analyzed with overexpression plants. The results showed thatoverexpression plants had 18 rosette leaves, while only 12 existed in wild-type plants.overexpression plants had visible flower buds on 33rd day, while wild-type plants were on the 20th day. The overexpressed plants showed late flower phenotype. The anatomical structure analysis of the shoot apical meristem showed that the growth cone ofoverexpression plants continued to grow and develop to a prominent height on the 19th day (compared to 15thday in wild-type plants), with multiple layers of tunica, corpus and pith meristem zone cells. These indicated that overexpression plants had delayed vegetative growth and maturity, leading to late flowering. The results of qRT-PCR on the expression level ofand its target geneshowed thatoverexpression plants regulated the floral transition by down-regulating and up-regulating the expression levels ofandduring plant growth.

; floral transition;gene; overexpression

Q756

A

1008-5394（2021）02-0025-06

10.19640/j.cnki.jtau.2021.02.005

2020-04-26

天津農(nóng)學(xué)院研究生培養(yǎng)質(zhì)量提升項(xiàng)目（101018）

尹晟（1994—），男，碩士在讀，從事果樹遺傳方面的研究。E-mail：554182342@qq.com。

龍鴻（1964—），男，教授，博士，主要從事果樹遺傳、發(fā)育生物學(xué)研究。E-mail：longhong@tjau.edu.cn。

責(zé)任編輯：楊霞