生物基質(zhì)中雌激素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析方法研究進(jìn)展

范茹婷， 肖華明， 察冬梅， 王 獻(xiàn)

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074)

1 前言

在生物基質(zhì)中總雌激素被定義為母體雌激素及其代謝產(chǎn)物的總和。母體雌激素包括雌酮和雌二醇，總代謝物是母體雌激素在2-，4-和16-途徑的代謝物的總和[1,2]。Xu等[3]對(duì)這些代謝物的代謝途徑進(jìn)行了研究。人體內(nèi)雌激素的濃度水平與機(jī)體功能和疾病有著密切的關(guān)系。當(dāng)雌激素的代謝趨向于因氧化而變得不平衡時(shí)，就會(huì)形成大量的加合物，大大增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[4]，可能引起的疾病有肝癌(肝纖維化)[5]、先兆子癇[1]、乳腺癌[6,7]等。在疾病的診斷和預(yù)防以及癌癥流行病學(xué)研究中，需要一種高度靈和高特異性的方法來確定雌激素的含量。目前雌激素的檢測(cè)涵蓋不同類型的生物樣本，如血液、尿液、乳腺癌細(xì)胞[8]、前列腺[9]、皮膚[10]、和乳房，以及腎上腺、睪丸、肝臟、卵巢和子宮等等[11,12]。為了研究人類生殖發(fā)育和疾病中雌激素的生物效應(yīng)，還會(huì)以小鼠、猴子為模型[1]來研究雌激素的代謝途徑。

生物組織和體液中的雌激素濃度通常較低，且濃度范圍跨度大[13]。青春期前的兒童、青少年，絕經(jīng)前和絕經(jīng)后婦女以及孕婦體內(nèi)的雌二醇濃度范圍的跨度高達(dá)兩個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，在如此寬的濃度范圍內(nèi)對(duì)雌激素進(jìn)行準(zhǔn)確定量是一項(xiàng)困難的工作[14]。此外，同分異構(gòu)體的存在(如雌激素的代謝物17α-雌二醇和17β-雌二醇)，使得雌激素檢測(cè)更加困難[15,16]。目前，生物樣本雌激素定量檢測(cè)的的主要方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[17 - 19]、放射免疫法(RIA)[20 - 22]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[23]及液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[24]。RIA和ELISA法等免疫測(cè)定已在臨床和環(huán)境實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用[25]。但是RIA法中的放射性元素需要嚴(yán)格控制，并且需要繁瑣耗時(shí)的操作過程[26]。ELISA法選擇性差，易與其他雌激素或試劑盒試劑發(fā)生交叉反應(yīng)[27]。GC-MS法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且熱穩(wěn)定性差的化合物容易發(fā)生復(fù)雜的源內(nèi)裂解，不利于GC-MS的精確定量[23]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)能夠?qū)崿F(xiàn)高通量快速檢測(cè)，且假陽性率低，適用于生物基質(zhì)中痕量類固醇化合物的分析，成為目前的主要檢測(cè)方法之一[24]。

雌激素的生物學(xué)功能研究及其代謝過程與疾病相關(guān)性信息的獲取，需要開發(fā)出對(duì)雌激素精確定量的分析方法。本文針對(duì)LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)不同生物基質(zhì)中雌激素的研究進(jìn)展，對(duì)樣品前處理、衍生化方法、色譜-質(zhì)譜的儀器與方法，以及不同類型的生物基質(zhì)中雌激素的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了綜述和討論，并對(duì)雌激素檢測(cè)領(lǐng)域未來需要解決的問題進(jìn)行了展望。

2 前處理方式

提取不同生物基質(zhì)中的雌激素，最常用的方法是液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)。雌激素分析流程如圖1所示，主要包括樣品的提取、衍生化及LC-MS/MS檢測(cè)三部分。

圖1 雌激素LC-MS/MS分析流程圖Fig.1 Flow chart of the LC-MS/MS analysis of estrogens

2.1 液-液萃取

LIE技術(shù)采用兩種極性不同并且互不相溶的溶劑來提取親脂性分析物，然后可以對(duì)其進(jìn)行有效干燥并重構(gòu)，以注入到LC-MS/MS系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)。LLE在蛋白質(zhì)沉淀方面也提供了重大改進(jìn)，可去除脂質(zhì)部分(包括磷脂)[27]。已有報(bào)道用乙酸乙酯[28]、甲基叔丁基醚(Methyltert-Butyl Ether,MTBE)[29,30]、氯丁烷[31]等有機(jī)溶劑從生物基質(zhì)中提取雌激素。在使用化學(xué)衍生化方法時(shí)，通常使用LLE進(jìn)行雌激素提取，通過優(yōu)化比較不同的提取溶劑發(fā)現(xiàn)使用乙酸乙酯回收率更高。而使用MTBE時(shí)，會(huì)出現(xiàn)更高的基質(zhì)效應(yīng)[28]。但是LLE需要使用大量有機(jī)溶劑，對(duì)人體健康和環(huán)境都會(huì)造成不利的影響[32]。

2.2 固相萃取

SPE與LC-MS/MS結(jié)合使用對(duì)于半自動(dòng)化樣品分析是一種非常有前景的技術(shù)。在線SPE的優(yōu)勢(shì)包括分析時(shí)間更短、濃縮富集增敏和減少樣本污染等，使得方法的靈敏度進(jìn)一步提高[33]。離線的SPE小柱通常涉及一系列固定相材料，且臨床應(yīng)用中都是可商用的C18反相柱或離子交換柱。Han等[34]計(jì)算了六種雌激素的logKOW范圍為2.94～4.52,疏水性中等，因此使用硅膠作為填料進(jìn)行分散固相萃取時(shí)，能夠比C18小柱更好地將中等極性的雌激素成分進(jìn)行保留。親脂-親水Oasis?HLB吸附相，對(duì)于類固醇類化合物具有極好的保留效果[35]。Zhao等[36]報(bào)道了一種僅使用一個(gè)SPE步驟測(cè)定尿液中游離雌激素的方法，該方法將樣品加載到Oasis HLB?(親水-親脂)柱上后，用乙酸乙酯洗脫游離的雌激素。Liu等[37]利用PRiME HLB固相萃取小柱可以有效地將牛乳和乳粉中的脂肪等干擾成分去除，在牛乳基質(zhì)中的加標(biāo)回收在87.7%～110.8%以內(nèi)。對(duì)于血清、血漿等復(fù)雜基質(zhì)，使用市售Oasis MCX?離子交換柱，通過陽離子交換作用可在洗脫雌激素之前，將血漿中的離子抑制作用降至最低，從而有效去除血漿樣品中的磷脂使樣品得到凈化[38]。Beinhauer等[39]通過將帶電本體衍生化和基于弱陽離子交換(WCX)RAM捕集柱相結(jié)合，進(jìn)行自動(dòng)在線捕集和洗脫樣品，簡(jiǎn)化的流程僅需100 μL血清，定量限可以達(dá)到3 pg/mL，適用于雌激素含量較低的人群，如年長(zhǎng)的男性、兒童和絕經(jīng)后的女性。磁性固相萃取(MSPE)技術(shù)也開始應(yīng)用于檢測(cè)生物基質(zhì)中的雌激素。Xiong等[40]開發(fā)了一種MSPE方法，采用具有雙十八烷基和2-氨基乙基-3-氨基丙基(C18/NH2-Fe3O4@mSiO2)官能團(tuán)的磁性介孔SiO2核-殼納米粒子，合成磁性納米顆粒作為MSPE的吸附劑。與傳統(tǒng)的SPE相比，其MSPE操作更簡(jiǎn)單，不需要特殊的儀器以及復(fù)雜的表面修飾。該方法應(yīng)用于檢測(cè)市售豬里脊肉和雞胸肉樣品中的十一種雌激素，檢出限為0.02±3.00 μg·kg-1。在復(fù)雜食品樣品中的痕量化合物進(jìn)行分析具有良好的可行性和前景。

3 化學(xué)衍生-LC-MS與直接LC-MS雌激素檢測(cè)方法對(duì)比

3.1 化學(xué)衍生與LC-MS聯(lián)用法

化學(xué)衍生化是一種常見的樣品前處理手段，通過與衍生試劑的反應(yīng)來修飾分析物上的官能團(tuán)，以增強(qiáng)分析物的紫外[41]、熒光[42]或質(zhì)譜響應(yīng)[43]。在LC-MS分析中，衍生試劑可以通過改變目標(biāo)化合物的活性基團(tuán)，例如胺基、羧基、羥基、硫醇基等來改變目標(biāo)化合物的色譜保留時(shí)間[44]。此外，還可以提高改性分析物的電離效率，從而有效提高其檢測(cè)靈敏度。類固醇雌激素和酚類異雌激素屬于弱酸，與其他極性較大的化學(xué)藥品相比，它們?cè)陔妵婌F電離-質(zhì)譜(ESI-MS)和大氣壓化學(xué)電離-質(zhì)譜(APCI-MS)上的電離效率不高[45]。通過化學(xué)衍生可以在類固醇雌激素和酚類異雌激素上增加部分親脂性基團(tuán)，從而提高電離效率，并增強(qiáng)質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)[46,47]。

丹磺酰氯(Dansyl Chloride,DNS)是使用率最高的衍生化試劑之一，常用于雌激素的衍生[28,48 - 50]。該試劑可以與酚羥基和氨基官能團(tuán)靶向結(jié)合，使化合物可用于熒光、紫外和質(zhì)譜分析檢測(cè)[51,52]。由于該試劑的二甲氨基基團(tuán)具有強(qiáng)質(zhì)子親和力，丹磺酰氯的衍生物表現(xiàn)出良好的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)。丹磺酰氯的質(zhì)譜增敏作用可輔助發(fā)現(xiàn)并定量人體內(nèi)潛在的雌激素代謝產(chǎn)物[53]。Van等[54]利用丹磺酰氯衍生一次性檢測(cè)出27種雌激素的代謝產(chǎn)物。丹磺酰氯與酚羥基的特異性反應(yīng)，還可以平行測(cè)定人體內(nèi)多種類固醇激素，實(shí)現(xiàn)針對(duì)一種疾病的類固醇代謝通路的高通量檢測(cè)[55]。盡管采用丹磺酰氯和吡啶-3-磺酰氯(Pyridine-3-sulfonyl Chloride,PS)進(jìn)行酚羥基的衍生化都是基于親核取代反應(yīng)，但是吡啶-3-磺酰氯中的吡啶基團(tuán)的有著較小尺寸，而小位阻的單-PS衍生物會(huì)增加雙酚的第二羥基部分的衍生化速率。引入帶堿性N的PS官能團(tuán)可將分子預(yù)測(cè)的pKa增加至2.5左右，從而促進(jìn)化合物在水溶液中的電離[56]，1-甲基咪唑-2-磺酰氯(1-Methylimidazole-2-sulfonyl Chloride,IS)[43]與丹磺酰氯反應(yīng)原理相類似，但是咪唑磺?；鹊せ酋；糠中∏矣H脂性較低，因此所有IS衍生產(chǎn)物的分析時(shí)間短并且所需的溶劑更少。Li等[30]檢測(cè)時(shí)使用orbitrap MS對(duì)精確質(zhì)量的母離子進(jìn)行定量，因此無需再處理碎片離子，使用1,2-二甲基咪唑-5-磺酰氯(1,2-Dimethylimidazole-5-sulfonyl Chloride,DMIS)則可以在很寬線性范圍內(nèi)監(jiān)測(cè)雌二醇特異性定性離子通道。與另一種已知的具有分析物特異性裂解的衍生試劑(吡啶-3-磺酰氯)相比，DMIS具有明顯的靈敏度優(yōu)勢(shì)。羥胺是可以同時(shí)對(duì)雌激素、雄激素、皮質(zhì)類固醇和孕酮的進(jìn)行衍生[57]。我們前期工作采用了一種羥胺衍生化技術(shù)與LC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的方法，可提高用于質(zhì)譜的電離效率，并同時(shí)定量了十種類固醇激素，包括雌激素，雄激素，孕酮和皮質(zhì)類固醇四類類固醇[58]。目前衍生化技術(shù)可以很好地提高雌激素的檢測(cè)靈敏度，但是定量檢測(cè)特異性差，用于定量的子離子碎片來源于衍生化試劑并非雌激素[36]。對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行非特異性的衍生化也增加了共流出的雜質(zhì)干擾，即很強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，因此尋找特異性和靈敏度兼具的衍生試劑也是當(dāng)前研究的難點(diǎn)之一。

3.2 直接LC-MS法

化學(xué)衍生化不是改善靈敏度的唯一解決方案。對(duì)于不衍生的雌激素通常使用負(fù)離子模式進(jìn)行測(cè)定，Yi等[59]使用0.05%氫氧化銨，在流動(dòng)相中添加氫氧化銨可以使雌二醇適當(dāng)電離，并使信號(hào)最大化，但是在堿性條件下對(duì)色譜柱有一定的腐蝕性。氟化銨可在負(fù)離子模式下為雌酮和雌二醇提供更好的信號(hào)，通常將氟化銨添加到與電噴霧負(fù)電離模式結(jié)合使用的流動(dòng)相中以增強(qiáng)未衍生雌激素的信號(hào)[9,60,61]。Julianne等[62]在LC的緩沖液中使用0.2 mmol/L氟化銨在負(fù)離子下促進(jìn)雌二醇的電離。通過這種方法提高了雌二醇檢測(cè)的靈敏度，足以檢測(cè)男性、絕經(jīng)前和絕經(jīng)后婦女血清中的雌二醇，定量限為2.61 pmol/L(0.71 pg/mL)。

4 色譜-質(zhì)譜雌激素分析檢測(cè)儀器

4.1 色譜

雌激素的檢測(cè)難點(diǎn)主要在于靈敏度低和特異性差。17β-雌二醇是雌二醇的活性立體異構(gòu)體，而其差向異構(gòu)體17α-雌二醇則沒有雌激素活性。為了選擇性地定量17β-雌二醇，則需要對(duì)這樣的異構(gòu)體進(jìn)行色譜分離。Yi等[59]使用納升LC分離雌激素，流速僅為35 μL/min，LC-MS/MS總檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)為3.5 min，最終在無衍生化的條件下測(cè)血清樣品的定量限為3.0 pg/mL。二維色譜可以通過減少不必要的LC洗脫液，確保樣品在線純化并減小對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)器的損傷[61,63]。Hemamalini等[14]采用二維色譜對(duì)雌激素進(jìn)行檢測(cè)，在11 min內(nèi)進(jìn)行在線純化和分離，雌二醇的定量限低至0.3 pg/mL。

4.2 離子源

ESI通過溶劑蒸發(fā)產(chǎn)生離子，適用于中等至高極性的分析物[64,65]。在APCI中，霧化的樣品通過電暈放電電離，從而提供較強(qiáng)的電離，適用于難以在溶液中形成離子的化合物，因此更適用于這些高脂溶性的類固醇[66,67]。盡管APCI可以提高非極性化合物的電離效率，但很少用于未衍生化的類固醇雌激素[68]。Higashi等[41]利用4-硝基苯甲酰氯在衍生化后引入硝基，使用ECAPCI-MS進(jìn)行檢測(cè)，比未衍生化的檢測(cè)響應(yīng)提高了8～23倍，血清樣本消耗量?jī)H為10 μL。Lien等[69]發(fā)現(xiàn)與其它電離源包括APCI相比，ESI對(duì)于丹磺酰氯衍生的雌激素化合物的信號(hào)強(qiáng)度更高。大氣壓光電離(APPI)是新興的電離源，能夠使非極性化合物電離，并且不易受到基質(zhì)效應(yīng)的影響。衍生物在APPI-MS和APCI-MS中幾乎只產(chǎn)生[M+H]+離子，且APPI-MS中衍生物的離子強(qiáng)度低于APCI-MS中的離子強(qiáng)度，但由于APPI-MS中的背景噪聲較低，因此可獲得更低的檢出限[45]。

4.3 質(zhì)量分析器

靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap)與三重四極桿相比，在檢測(cè)1-甲基咪唑-2-磺?；萍に匮苌锓矫嫣禺愋杂辛颂岣遊43]，雌激素衍生物用于定量的碎片離子大多數(shù)是衍生試劑上的非特異性的碎片離子，Orbitrap MS采用更精確的母離子進(jìn)行分析物定量，因此無需處理碎片離子，該方法采用選擇離子模式監(jiān)測(cè)18種類固醇，檢出限可達(dá)到0.02～12 pg/mL。Darville等[70]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了方法優(yōu)化，使用高分辨率(HR)Orbitrap質(zhì)譜儀量化人尿中所有15種1-甲基咪唑-2-磺酰氯衍生的雌激素和雌激素代謝物，定量限在1～20 pg/mL之間。Li等[71]利用AB Sciex QTRAP系列儀器中的Analyst軟件提供的Sum Multiple Ion功能實(shí)現(xiàn)5次多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式的采集并進(jìn)行加和，與未加和的結(jié)果相比靈敏度提高了3～4倍。

5 不同生物基質(zhì)中雌激素的檢測(cè)研究進(jìn)展

在各種臨床樣本中，血清和血漿最為常見，而尿液，唾液等樣本由于簡(jiǎn)單易獲取，也越來越多地應(yīng)用于臨床中。測(cè)量生物基質(zhì)中的內(nèi)源激素的難度在于其低生理濃度和復(fù)雜基質(zhì)的干擾。在尿液和血漿中，類固醇主要以葡醛酸苷、硫酸鹽或它們的混合物的形式存在，其他的大多數(shù)結(jié)合在載體蛋白(如性激素結(jié)合球蛋白或白蛋白)上，而未結(jié)合或“游離”的濃度極低。因此，很難對(duì)生物體液中游離的雌激素進(jìn)行分離分析[43]。

血液樣本已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)，如臍帶血、母體血清中雌激素的測(cè)定已被納入產(chǎn)前出血、自閉癥或先兆流產(chǎn)的檢測(cè)中。在胎兒的血清中循環(huán)的類固醇激素的濃度比在母親的血清中濃度高得多，這就意味著可能需要建立更寬的測(cè)量范圍[72]。血清的樣本采集通常需要靜脈穿刺，這種作為侵入式的樣本采集方法，需要現(xiàn)場(chǎng)有接受專業(yè)培訓(xùn)的人員，并且采集到的樣本需要在冷凍條件下保存[73]，這些復(fù)雜的程序使得血液樣本的獲取增加了難度。

測(cè)量合并的24 h尿液樣本已成為研究腎上腺類固醇的重要手段[51]。血漿中僅有少量的類固醇在尿液中原樣代謝，其余通過肝臟代謝。每種類固醇都會(huì)產(chǎn)生大量肝代謝產(chǎn)物，其中大多數(shù)類固醇的代謝物含有額外的羥基并與硫酸鹽或葡糖醛酸苷部分相連，所以它們更易溶解，易于被腎臟排泄。Van等[54]設(shè)計(jì)了一種通過多步固相萃取方法，將樣品純化后，對(duì)水溶性較低的部分進(jìn)行衍生化，僅用6 mL的尿液樣本就可以完成包括母體雌激素、羥基化和甲基化形式、16α-羥基雌激素途徑的代謝物、硫酸鹽和葡糖醛酸化物結(jié)合形式的雌激素的分析。

唾液通常被用作生物基質(zhì)，因?yàn)樗梢苑乔秩胧饺硬⑶壹词乖诜桥P床環(huán)境中也很容易收集。此外，大多數(shù)循環(huán)激素以非生物活性激素的形式與載體蛋白結(jié)合，而唾液類固醇激素的濃度與血液中游離的和未結(jié)合的激素組分密切相關(guān)，因此可輕松獲得生物活性激素組分的測(cè)量值[71]。Wei等[74]使用API 5000光譜儀與在線SPE相結(jié)合的方法，首次實(shí)現(xiàn)唾液雌二醇未衍生化的雌二醇的LC-MS/MS分析測(cè)定，僅用100 μL唾液同時(shí)鑒定和定量唾液樣品中的雌二醇和其它六種類固醇激素靈敏度為1 pg/mL。近五年不同生物基質(zhì)的檢測(cè)方法如表1所示。

表1 近五年LC-MS/MS檢測(cè)雌激素匯總

6 結(jié)語

精確定量分析生物基質(zhì)中的雌激素有助于了解生物體的代謝過程和病理學(xué)的診斷。近年來，雖然關(guān)于LC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)雌激素的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是目前還存在一些制約因素：衍生化雌激素一方面取決于衍生化試劑的特性，另一方面也和離子源的離子化效率和碰撞碎裂有關(guān)。盡管衍生化技術(shù)可以極大地提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度，但是受到生物基質(zhì)中的干擾，導(dǎo)致衍生化后基質(zhì)效應(yīng)增加，以及無特異性的衍生試劑會(huì)對(duì)測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。選擇性和靈敏度對(duì)于質(zhì)譜的高通量分析來說依然不可兼得，分離和儀器條件仍然是類固醇檢測(cè)的制約因素。

基于目前雌激素檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)，生物基質(zhì)中雌激素的LC-MS/MS檢測(cè)方法有待從以下幾個(gè)方面進(jìn)行改善：(1)根據(jù)不同基質(zhì)選用不同的前處理方法以減少基質(zhì)效應(yīng)。樣本量大且易獲得的如尿液、唾液等生物樣本，可以利用固相萃取的方法更好的降低背景噪聲；根據(jù)確定雌激素的參考范圍選擇衍生化或者不衍生化；(2)尋找特異性更強(qiáng)的衍生化試劑。目前使用的衍生化試劑自身響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)，對(duì)定量目標(biāo)化合物會(huì)造成干擾。因此，有必要開發(fā)能夠產(chǎn)生與雌激素結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)的碎片離子的衍生化試劑；(3)進(jìn)一步改進(jìn)和發(fā)展質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，例如，使用納升色譜，二維色譜進(jìn)樣，為雌激素的檢測(cè)提供硬件支持。

隨著越來越多樣品前處理方法的出現(xiàn)，新的化學(xué)衍生試劑不斷被發(fā)現(xiàn)，LC-MS分析方法的研究與開發(fā)，LC-MS雌激素分析技術(shù)有望成為臨床病理研究和診斷領(lǐng)域的重要方法，并日益廣泛的應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中。