鞣花酸分子印跡聚合物的合成及其性能研究

鄒佳美， 平欲暉， 吳麗芳， 雙若男， 毛娟玲， 謝一輝

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330004)

多酚類物質(zhì)是一類具有多酚結(jié)構(gòu)并具有抗氧化[1]、抑菌[2]、抑制酶活性[3]、抗癌[4]、抗病毒[5]和降血脂[6]等功效的化合物。鞣花酸(Ellagic Acid,EA)是一種天然多酚組分，是沒(méi)食子酸的二聚體形式，是一種多酚二內(nèi)酯，存在于許多軟性水果、堅(jiān)果和其他植物組織中，如石榴[7,8]、草莓[9,10]、核桃[11,12]。EA具有抗氧化、抗凝血、抗菌抗病毒、抑制致癌劑的代謝活性[13 - 15]，主要應(yīng)用于藥品、化妝品以及保健品的添加劑[14]。傳統(tǒng)的從植物粗提物中純化EA的方法有重結(jié)晶法和液-液萃取法，這些方法雖然低成本、易操作，但繁瑣、低效，并伴隨著大量有機(jī)溶劑的消耗，難以得到技術(shù)上的推廣。

分子印跡技術(shù)(Molecularly Imprinting Technology,MIT)是以特定的目標(biāo)化合物為模板分子，制備對(duì)該目標(biāo)化合物及其結(jié)構(gòu)類似物具有選擇性識(shí)別能力的聚合物技術(shù)。它具有分離效率高、化學(xué)物理性質(zhì)穩(wěn)定、制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。目前，分子印跡技術(shù)廣泛應(yīng)用于環(huán)境中微量物質(zhì)的分析[15]、藥物分析[16]等的研究中，在離子液體[17]、熒光探針技術(shù)[18]、電化學(xué)傳感[19]也有應(yīng)用。另外，分子印跡技術(shù)目前在天然產(chǎn)物的提取分離研究中也有一定的應(yīng)用。目前，以EA為模板分子的印跡聚合物(MIPs)用于多酚類成分的富集研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用沉淀聚合法合成EA-MIPS，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行表征，有望為天然藥物化學(xué)成分多酚的高選擇性分離、富集、純化提供一種新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；5700型紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet公司；TriStar3000全自動(dòng)比表面積及孔隙度測(cè)定儀，美國(guó)麥克公司；Quanta 250型掃描電子顯微鏡，美國(guó)FEI公司；CHY-2型恒溫振蕩器，江蘇金壇富華儀器有限公司；SK-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-HS型恒溫水浴鍋，上海南陽(yáng)儀器公司；GT10-1型高速臺(tái)式離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

鞣花酸(EA)(批號(hào)：BCTG -0302，純度98%)、槲皮素(QUE)(批號(hào)：BCTG-0238，純度98%)、沒(méi)食子酸(GA)(批號(hào)：BCTG-0177，純度98%)，均購(gòu)自江西本草天工科技有限責(zé)任公司；丙烯酰胺(AM)，上海山浦化工有限公司；4-乙烯基吡啶(4-VP)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、甲醇、二甲基亞砜、乙酸，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 鞣花酸分子印跡微聚合物的制備采用沉淀聚合法制備MIPs。將模板分子(EA)和功能單體(AM、4-VP)溶解在裝有致孔劑的圓底燒瓶中，密封，常溫振蕩1 h預(yù)聚合。再加入交聯(lián)劑(EDMA)及0.03 g引發(fā)劑(AIBN)，通氮?dú)夂竺芊?，放置于水浴鍋中聚?4 h，得到聚合物。待反應(yīng)完成后，加入甲醇-乙酸溶液(8∶2，V/V)超聲30 min，然后在離心機(jī)中5 000 r/min離心，反復(fù)幾次，直到上清液中紫外檢測(cè)不出模板分子。然后用甲醇洗至中性，得到MIPS，最后于60 ℃烘干。非分子印跡聚合物(Nonimprinted Polymers,NIPS)除不加入模板分子外，其余步驟同上。

1.2.2 印跡聚合物制備條件的選擇MIPs制備以功能單體的用量(A)、交聯(lián)劑用量(B)、溶劑用量(C)和溫度(D)4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，各因素分別取3個(gè)水平，以靜態(tài)吸附容量(Q)作為考察指標(biāo)，研究上述因素對(duì)MIPs的性能影響，其因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

1.2.3 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)稱取一系列質(zhì)量為25 mg的MIPs和NIPS,置于10 mL的離心管中，分別加入濃度為10、20、40、60、80、100 μg/mL的EA標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，恒溫吸附至飽和，離心，取上清溶液適當(dāng)稀釋后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，計(jì)算聚合物對(duì)底物的吸附容量(Q)。再根據(jù)Q值與初始濃度c0繪制等溫吸附曲線。Q=(c0-cs)·V/m，式中Q為靜態(tài)平衡吸附容量(μmol/g)，c0為模板分子始濃度(μmol/L)，cs為吸附平衡時(shí)濃度(μmol/L)，V為底物溶液的體積(mL)，m為聚合物的使用量(mg)[1]。

1.2.4 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取MIPS和NIPS各6份，每份25 mg，置于10 mL的離心管中，然后再加入5 mL 60 μg/mL的EA標(biāo)準(zhǔn)溶液并混合均勻，室溫下分別振蕩1 h、2 h、4 h、6 h、8 h后，離心，取上清液適當(dāng)稀釋后，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每組樣品的吸光度。根據(jù)上述方法計(jì)算出聚合物對(duì)底物的Q值，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線，確定吸附飽和時(shí)間。

1.2.5 選擇性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取MIPS25 mg，分別加入20 μg/mL的EA、GA、QUE標(biāo)準(zhǔn)溶液各5 mL，于室溫下振蕩6 h。按照上述方法計(jì)算MIPs對(duì)底物的結(jié)合量，分別求出聚合物靜態(tài)分配系數(shù)(K)和分離因子(α)[20]，研究MIPs對(duì)不同底物的特異吸附能力。其中，K=ca/cs，α=Ki/Kj，式中ca為結(jié)合底物的濃度，cs為吸附平衡時(shí)底物在溶液中的濃度，i為模板分子，j為底物分子；規(guī)定若j=i，α=1；若α<1，表明MIPS對(duì)其模板分子沒(méi)有選擇性；若α>1，則表明MIPS對(duì)模板分子具有一定的選擇性。

2 結(jié)果與討論

2.1 功能單體的選擇

通常，酸性的模板分子適合堿性的功能單體，堿性的模板分子則適合酸性的功能單體。由于EA是多酚類化合物，具有一定的酸性，從理論而言堿性的功能單體有利于功能單體形成穩(wěn)定的主客復(fù)合物。本實(shí)驗(yàn)取4-VP和AM兩種功能單體，分別合成得到EA-MIPs，通過(guò)對(duì)EA不同質(zhì)量濃度(20、40、60 μg/mL)溶液的靜態(tài)吸附試驗(yàn)，計(jì)算吸附EA的濃度。得到功能單體對(duì)EA-MIPs性能的影響，如圖1所示。由圖可知，以4-VP為功能單體形成的MIPs的吸附容量顯著高于AM，故選擇4-VP作為功能單體。

圖1 功能單體對(duì)印跡聚合物的影響Fig.1 Effect of functional monomers on imprinted polymers

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

為了得到吸附效果較好的EA-MIPs，經(jīng)單因素優(yōu)化和相關(guān)參考文獻(xiàn)，確定模板分子和功能單體的摩爾比為1∶2～1∶6，模板分子與交聯(lián)劑的摩爾比為1∶10～1∶30，反應(yīng)溶劑的用量為50～60 mL(1 mmol EA)，溫度為60～70 ℃，AIBN為30 mg。并進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，以靜態(tài)吸附容量作為考察指標(biāo)，優(yōu)化聚合物的合成條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知，聚合反應(yīng)的最佳條件是A3B1C3D2，即n(EA∶4-VP∶EDMA)=1∶6∶10，溶劑用量為70 mL，聚合溫度為65 ℃。由R值可知A的影響最大，其次是B、D、C。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 比表面積測(cè)定和掃描電鏡結(jié)果分析

根據(jù)不同的掃描電鏡圖譜(圖2)和比表面積測(cè)試結(jié)果(表3)可知，MIPS1、MIPS9的粘連很嚴(yán)重，而且粒徑較大,比表面積較??；MIPS2、MIPS3、MIPS4的大小很不均一；MIPS5粘連嚴(yán)重，球形不規(guī)則，比表面積?。籑IPS6發(fā)生團(tuán)聚，分散性較差；總體來(lái)說(shuō)，MIPS7、MIPS8微球光滑均勻，球形度較好，且比表面積大，吸附能力強(qiáng)。

表3 比表面積測(cè)試結(jié)果

圖2 不同MIPS的掃描電鏡圖Fig.2 Scan electron microscopic images of different MIPS

2.4 鞣花酸印跡聚合物的表征

將真空干燥后聚合物用掃描電鏡和傅里葉紅外(IR)光譜表征。由掃描電鏡結(jié)果可知，MIPS7微球形態(tài)最好，故對(duì)模板分子、MIPS7進(jìn)行紅外光譜分析，見(jiàn)圖3。由于EDMA具有α,β不飽和酯結(jié)構(gòu)，其C=O的伸縮振動(dòng)峰應(yīng)該在1 715～1 730 cm-1，從紅外光譜圖可以看出，MIPS的IR圖中吸收峰為1 735 cm-1，為飽和酯的C=O的伸縮振動(dòng)峰，表明聚合成功。MIPS的IR圖與EA的IR圖比較，前者少了EA中的3組特征峰，芳環(huán)內(nèi)酯C=O特征雙峰1 735 cm-1、1 700 cm-1，共軛苯環(huán)特征峰1 600 cm-1、1 580 cm-1、1 500 cm-1及指紋區(qū)的C-H的面外彎曲振動(dòng)峰750 cm-1，說(shuō)明模板分子已洗脫。

圖3 MIPS(a)和EA(b)的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrograms of MIPS(a) and EA(b)

2.5 靜態(tài)試驗(yàn)吸附結(jié)果和Scatchard分析

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知MIPS7有較好的吸附性能，故用MIPS7來(lái)進(jìn)行等溫吸附實(shí)驗(yàn)。從圖4可知聚合物對(duì)底物的Q隨EA濃度的增大而增大，且在高濃度范圍內(nèi)，吸附達(dá)到飽和狀態(tài)。同時(shí)，不同濃度條件下MIPS的Q均大于對(duì)應(yīng)的NIPS。這是因模板分子經(jīng)過(guò)洗脫后在聚合物的空間和結(jié)構(gòu)上留下“印跡空穴”，當(dāng)與模板分子相似的結(jié)構(gòu)進(jìn)入“空穴”后會(huì)產(chǎn)生特異性結(jié)合。而空白印跡聚合物為不含有與模板分子結(jié)構(gòu)相似的“空穴”。為了更直觀準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)MIPS的吸附性能，對(duì)EA與目標(biāo)分子的結(jié)合采用Scatchard方程[21]來(lái)反映，Scatchard方程為：Q/cEA=(Qmax-Q)/Kd，Q為吸附容量，μmol/g；Kd是結(jié)合位點(diǎn)平衡離解常數(shù)；Qmax是結(jié)合位點(diǎn)最大吸附容量，μmol/g；cEA是底物在上清液中的平衡質(zhì)量濃度，μmol/L；所得方程分別為：y1=0.01072x+0.1192，聚合物結(jié)合位點(diǎn)的平衡常數(shù)Kd=93.26 μmol/mL，最大表觀結(jié)合量Qmax=11.11 μmol/g；y2=-0.4713x+5.2802，聚合物結(jié)合位點(diǎn)的平衡常數(shù)Kd=2.12 μmol/mL，最大表觀結(jié)合量Qmax=11.19 μmol/g。由圖5可知有兩條較好的線性關(guān)系的直線，可能是由于EA和目標(biāo)分子之間以不同的配比進(jìn)行組合，形成了兩種性質(zhì)不同的空穴。

圖4 MIPS和NIPS等溫吸附曲線Fig.4 Isothermals adsorption curve of MIPS and NIPS

圖5 MIPS的Scatchard方程Fig.5 Scatchard equation for MIPS

2.6 動(dòng)態(tài)吸附性能研究

EA動(dòng)態(tài)吸附結(jié)果如圖6，MIPS7和NIPS7前6 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Q都逐漸增大且MIPS7的Q要高于NIPS7。當(dāng)振搖6 h后，隨著時(shí)間的增加，Q變化不大，故在6 h時(shí)EA MIPS達(dá)到吸附飽和。

圖6 MIPs和NIPS的動(dòng)力吸附曲線Fig.6 Kinetic adsorption curves of MIPs and NIPS

2.7 選擇性識(shí)別性能

為考察EA-MIPS的選擇性識(shí)別能力，選擇沒(méi)食子酸、槲皮素作為干擾物進(jìn)行選擇性吸附試驗(yàn)。MIPS7具有較好的吸附性能，因此本實(shí)驗(yàn)考察MIPS7對(duì)各底物分子的選擇性。結(jié)果如表4所示，MIPS7對(duì)EA的分配系數(shù)明顯高于GA和QUE，且分離因子α>1，表明MIPS對(duì)EA的吸附具有選擇性。

表4 MIPS對(duì)各底物的識(shí)別性能

3 結(jié)論

采用沉淀聚合法確定鞣花酸(EA)分子印跡聚合物制備適宜條件如下：70 mL二甲基亞砜溶液(1 mmol EA)為致孔劑，4-VP為功能單體，65 ℃恒溫水浴法攪拌。在n(EA∶4-VP∶EDMA)=1∶6∶10時(shí)，合成的聚合物在6 h時(shí)達(dá)到最大吸附容量，為10.865 μmol/g，分離因子α均超過(guò)1，表明MIPS對(duì)鞣花酸的吸附有特異性。方法可選擇性識(shí)別EA，為EA及酚酸類成分分離富集提供參考。