云南新平蔗區(qū)發(fā)現甘蔗白條病

王長秘，張榮躍，李婕，王曉燕，單紅麗，倉曉燕，黃應昆

（云南省農業(yè)科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南開遠 661699）

0 引言

甘蔗白條病是由白條黃單胞菌[Xanthomonas albilineans(Ashby)Dowson]引起的一種系統(tǒng)性維管束細菌性病害[1]。X.albilineans屬于專性好氧型革蘭氏陰性細菌，其菌落具有表面平滑、外形圓整、顏色為淺黃色或蜜黃色、菌液粘稠狀的特點[2]。X.albilineans能夠在甘蔗莖、葉上定殖，在莖上定殖后莖中下部會長出許多側芽，莖基部出現分蘗，嚴重時導致植株枯死等癥狀[3]；在葉上定殖后病原菌從主莖葉、分蘗葉和側枝葉木質部侵入并產生大量的黃單胞毒素，阻斷葉綠體分化從而影響光合作用，形成與葉片主脈平行的白色條紋[1]，導致甘蔗產量和品質的大幅度下降，造成巨大經濟損失[3-4]。白條病具有潛伏期，可持續(xù)幾個月甚至幾年未表現出癥狀[5]。因此，白條病具有危害性大、潛伏期長的特點。

該病19 世紀20 年代在印度尼西亞爪哇島、澳大利亞和斐濟被首次發(fā)現報道，現已廣泛發(fā)生于美國、古巴、巴西、澳大利亞、法國、印度和巴基斯坦等至少66 個國家[6]。1980 年在我國福建、廣東、江西、海南、臺灣等蔗區(qū)均有報道[7-9]。2017年李文鳳等[10]利用分子生物學技術手段首次檢測到廣西北海、來賓、百色蔗區(qū)甘蔗白條病病原。2019 年張榮躍等[2]通過病原菌分離和分子生物學鑒定在云南保山、孟定和金平蔗區(qū)的甘蔗上也發(fā)現了白條病。2019 年在云南新平蔗區(qū)發(fā)現了疑似白條病的病害，為明確該病害的致病病原，本文采用田間診斷和分子生物學技術相結合方法，開展病原鑒定，為今后白條病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采自云南新平甘蔗‘新臺糖1 號’的8份疑似甘蔗白條病樣品信息：XP1S（登錄號MT625864）、XP2S（登錄號MT625865）、XP3S（登錄號MT625866）、XP4S（登錄號MT625867）、XP5S（登錄號MT625868）、XP6S（登錄號MT625869）、XP7S（登錄號MT625870）、XP8S（登錄號MT625871）。

1.2 蔗汁總DNA提取

將蔗莖表面用自來水清洗3 次去除表面污物，75%的酒精消毒20 s 后，用火將表面酒精燒盡，重復2 次進行表面消毒。把蔗莖切成長為5～8 cm 的塊莖，通過擠壓方法收集蔗汁。吸取2 mL 蔗汁于離心管中，12 000 r/min 離心10 min，棄上清液，沉淀使用植物基因組DNA 提取試劑盒提取DNA[天根生化科技（北京）有限公司，中國]，具體步驟參照說明書進行操作。

1.3 PCR檢測

以蔗汁總DNA 為模板，使用X.albilineans檢測特異性引物（XAF1：5’-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3’，XAR15’-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3’）[11]進行PCR 檢測。該引物靶標X.albilineans基因組上的三磷酸腺苷結合盒（adenosine triphosphate-biding cassette，ABC）轉運蛋白基因（abc），基因號為XALc_1791[12]。25μL 擴增反應體系為dd H2O 10.5μL、2×EasyTaq SuperMix 12.5μL、上游引物0.5μL（20μg/μL）、下游引物0.5μL（20μg/μL）、DNA 模板1μL。PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，65℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，10個循環(huán)；94 ℃變性45 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，10 個循環(huán)；94 ℃變性45 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，10個循環(huán)；12 ℃保存。取10μL用1.5%瓊脂糖凝膠進行擴增產物電泳檢測。

1.4 PCR產物克隆及測序分析

利用膠回收試劑盒（北京全式金生物技術有限公司，中國）進行PCR產物回收，產物使用pEASY-T5克隆載體（北京全式金生物技術有限公司，中國）進行克隆。挑選5 個陽性克隆送華大基因測序。將測序所得序列在NCBI 官網上BLAST 檢索，使用DNAMAN V 8.0 進行序列一致性分析。運用MEGA 6.0 軟件結合表1中菌株的核酸序列采用鄰接法（Neighbor-joining）建樹，模式選Kimura2-parameter，自舉檢測（Bootstrap）重復1 000次，構建系統(tǒng)進化樹（表1）。

表1 構建系統(tǒng)進化樹菌株相關信息Table 1 Information of strains for constructing phylogenetic tree

2 結果與分析

2.1 PCR檢測

PCR 分子檢測結果表明，8 份疑似甘蔗白條病樣品XP1S～XP8S 檢測到目的條帶，大小約為600 bp，與陽性對照條帶一致。陰性對照和無菌水對照均沒有擴增出目的條帶（圖1）。

圖1 8份疑似甘蔗白條病樣品的PCR檢測結果Fig. 1 PCR detection of 8 suspected sugarcane leaf scald samples

2.2 序列分析

測序結果表明8個白條黃單胞菌菌株PCR擴增產物核苷酸序列均為608 bp，一致性為100%。將這8條白條黃單胞菌abc基因序列上傳NCBI 數據庫，GenBank 登錄號為MT625864～MT625871。BLAST 結果表明，這些核苷酸序列與來自法國白條黃單胞菌GPE PC73 菌株（GenBank 登錄號：FP565176）對應的基因序列完全一致。將本文獲得8 條序列結合不同黃單胞菌屬的abc基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結果表明，本研究得到的序列與X.albilineans菌株處于同一進化分支，但與同屬不同種病菌有明顯區(qū)分。初步推斷這8 份樣品感染了X.albilineans。

圖2 基于甘蔗白條病菌abc基因核苷酸序列系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Phylogenetic analysis based on abc genes of X.albilineans strains obtained in this study and other Xanthomonas strains

3 討論與結論

通過田間癥狀診斷和PCR 分子鑒定技術，確認云南省新平蔗區(qū)發(fā)現了由X.albilineans引起的甘蔗白條病。白條病是一種可以從維管束、木質部、韌皮部、薄壁細胞侵染甘蔗的細菌性病害，遇到合適的甘蔗品種和環(huán)境條件白條病就可能大面積發(fā)生[13-14]。X.albilineans通過砍收過程中的農事操作進行短距離傳播，以帶病種莖進行長距離傳播，其中種莖是最主要的傳播方式[15-17]，于是在我國2007 年將致病性白條黃單胞菌X.albilineans列入進境植物檢疫名錄[18]。通過野生種質資源的挖掘和抗病材料的運用，篩選抗病健康種苗是甘蔗白條病防治的最好方法[19-20]。

19世紀80年代，甘蔗白條病僅在我國臺灣、福建、廣東蔗區(qū)有發(fā)生，現在在廣西、海南、浙江、云南也有報道[2,10,21-22]。白條病具有危害性大，潛伏期長的特點。因此，必須加強引種檢疫和補齊引種檢疫的短板，從源頭上阻斷病害的傳播和蔓延。同時應加強該病害的發(fā)生情況調查，及時掌握各蔗區(qū)白條病發(fā)病情況和流行規(guī)律，及早做好預防工作，將白條病的發(fā)生和危害控制在閾值之下。甘蔗白條病的檢測、監(jiān)測、預警及檢疫工作具有重要的意義。本研究是云南新平蔗區(qū)白條病發(fā)生的首次報道，將為今后白條病的監(jiān)測、預警、防控研究奠定基礎。

Occurrence of Sugarcane Leaf Scald in Sugarcane Planting Area of Xinping,Yunnan Province,China